重组F基因缺失型仙台病毒hFGF2基因治疗制剂质控方法及质量标准的建立

目的建立搭载2型人成纤维细胞生长因子(human fibroblast growth factor 2,h FGF2)重组F基因缺失型仙台病毒(Sendai virus,Se V)制剂(Se V-h FGF2/d F)的质控方法与质量标准。方法采用RT-PCR法对Se V载体中插入的目的基因h FGF2和缺失的F基因进行鉴别,同时扩增两个基因片段M-HN和h FGF2-NP,以鉴别该病毒;鸡红细胞凝集试验检测制品的血凝效价,并计算病毒颗粒数;免疫荧光法测定Se V-h FGF2/d F的感染滴度,结合病毒颗粒数计算其比滴度;Se V-h FGF2/d F体外感染COS7细胞后,ELISA法测定感染上清中h FGF2的表达量;将感染上清体外作用于BALB/c 3T3细胞,3T3细胞增殖法检测h FGF2的生物学活性;酚-氯仿法抽提样品的DNA,Pico-Green法测定制品中DNA残留量;PCR法检测腺病毒残留。结果重组Se V-h FGF2/d F基因组中h FGF2基因、F基因、M-HN片段和h FGF2-NP片段的RT-PCR鉴定结果与理论值相符;血凝效价为1∶512,病毒颗粒数为4.12×1010 VP/ml;感染滴度为2.06×109 CIU/ml,比滴度为5.0%;Se V-h FGF2/d F以MOI 10感染COS7细胞72 h后,ELISA检测上清中h FGF2的表达量为117.1 ng/ml;表达上清中h FGF2的生物学活性为437 IU/ml;DNA残留量为2.24 ng/ml;制品中腺病毒的PCR检测结果为阴性;其他各项指标均符合《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》及《中国药典》三部(2010版)要求。结论初步建立了Se V-h FGF2/d F的质控方法和质量标准,为保证该制品的安全、有效、质量可控奠定了基础,同时也为其他Se V载体基因治疗药物的质量控制提供了参考。

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagX基因缺失株的构建与鉴定

目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)IV型分泌系统cagX基因缺失株,为研究cagX基因的功能奠定基础。方法:利用基因同源重组原理,设计cagX基因上下游同源臂片段,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后酶切鉴定,将纯化后的同源臂片段连接到含卡那霉素抗性基因的载体pBluescript SKⅡ(-),即cagX基因自杀质粒pBlueKM40-ΔcagX;自杀质粒电击转化HpNCTC 11637,通过卡那霉素筛选基因缺失株,后经PCR和DNA测序鉴定。结果:构建成功了幽门螺杆菌cagX基因自杀质粒,并转化至HpNCTC 11637内。结论:成功获得了幽门螺杆菌cagX基因缺失株Hp11637-ΔcagX。

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备及其在疫苗研制中的应用

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原体。病毒衣壳唯一的结构蛋白Cap是PCV2亚单位疫苗的主要靶点。本研究旨在利用重组伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失株来表达PCV2的Cap,该缺失株在PRV标记疫苗中被广泛使用。试验使用同源重组技术构建了重组PRV病毒株gE(-)/PCV2cap(+)PRV,其中PRV病毒株gE基因上游被PCV2的Cap基因替代。通过免疫荧光技术和Western blotting方法证实重组病毒复制过程中可表达Cap蛋白。电子显微镜结果显示,所表达的Cap蛋白能组装成病毒样颗粒(VLP)。用纯化的VLPs免疫小鼠和豚鼠可产生针对PCV2Cap的特异性免疫应答。这些结果提供了一种基于VLP构建PCV2亚单位疫苗的方法。

复制缺陷型P基因缺失狂犬病病毒的构建及其特性研究

狂犬病病毒的P蛋白可以通过抑制固有免疫通路及干扰素通路的方式,抑制干扰素的产生及干扰素诱导基因的表达水平,从而使狂犬病病毒产生对宿主固有免疫的抑制,逃避宿主的固有免疫应答。国外对狂犬病病毒Flury HEP株和SAD

ORF2基因缺失的PCV2的构建与部分生物学特性

设计了1对特异性引物,从疑似PMWS(断乳仔猪多系统衰竭综合征)的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后形成重组质粒pMD18-T Simple-PCV2(命名为P-S-PCV2)。用ORF2特异的限制性内切酶EcoRⅠ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF2基因缺失突变的重组质粒(命名为P-S-PCV2-B)。用SacⅡ酶对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化的基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应的基因缺失病毒粒子(命名为PCV2-B)。用PCV2-B缺失突变株进行了细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究,结果显示,PCV2-B转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长。PCV2-B接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV-B突变病毒的感染。PCV2-B免疫仔猪后抗体没有升高;CD3+和CD4+整体水平下降,第2周与对照组差异显著;CD8+与对照组差异不显著。结果表明,ORF2基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,免疫原性减弱,细胞免疫被部分激活。

弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。