重组MAGE-A1/EGFP质粒转染人树突状细胞体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫

目的:应用人重组真核表达载体pMAGE-A1/EGFP转染的树突状细胞(DCs)在体外诱导MAGE-A1特异性T 细胞免疫。方法:构建重组质粒pMAGE-A1/EGFP,体外电转染该质粒入DCs,通过流式细胞仪检测和胞内染色法LDH法比较转染前后DCs在蛋白表达、细胞成熟度和诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫能力的差异。结果:成功构建pMAGE-A1/EGFP 真核表达质粒,电穿孔法导入DCs后观察到MAGE-A1与EPFG实现等效表达,分别为8．8％±0．9％和8．47％±0．78％。 pMAGE-A1/EGFP转染的DCs表面CD86、CD40L和CD83表达水平显著升高,提示DCs的成熟度增加;同时表达的MAGE-A1 蛋白可与小鼠来源抗MAGE-A1的单抗发生特异性结合,并在体外诱导MAGE-A1特异性CD4+T细胞克隆扩增,当再次接触 MAGE-A1抗原时大量分泌IFN-γ。结论:pMAGE-A1/EGFP转染的DCs不仅能在体外诱导MAGE-A1特异性T细胞免疫,还可通过流式细胞仪进行快速检测,为临床开展MAGE-A1为基础的免疫治疗奠定了一定基础。

类风湿性关节炎病人关节滑膜液与外周血中G1特异性T细胞的特点

目的为比较研究类风湿性关节炎病人 T细胞库中是否存在 G1特异性 T淋巴细胞极其生物学特性。方法应用重组人软骨抗原凝集原 G1为抗原 (r G1) ,采用国际标准半有限稀释建立细胞株法 ,从类风湿性关节炎病人外周血中分离建立 G1特异性 T细胞并分析其生物学特性。结果从 4名类风湿性关节炎病人外周血中分别分离建立了 13株 G1特异性 T细胞株。分析比较了这些细胞株 ,发现病人的 G1特异性 T淋巴细胞出现频率为 36 .2 %。所有 T细胞株与 r G1及 WT和 PPD共同培养以观察其特异性反应性 ,结果发现所建立的 13株 T细胞株对人软骨抗原凝集素 G1区具有良好的特异性。进一步用r G1肽段分析 ,发现其中 5株主要对 G1C末端呈特异性反应。细胞表型分析发现 ,所有这些 T细胞株均表现为 CD3+、CD4+与αβ TCR阳性 ;细胞因子分泌类型以 TH1为主。结论 RA病人外周血与关节滑膜液中均有 G1特异性 T细胞。

人rG1特异反应性T细胞生物学特性的研究

目的分析重组人软骨抗原凝集原 (rG1 )体外诱导建立的 1 1株rG1特异性T细胞株的生物学特性。方法采用直接标记免疫荧光法对rG1特异性T细胞株进行表型分析 ;采用QuantikineELISAKits定量检测细胞培养上清液中的IFN -γ与IL - 4;采用RT -PCR方法分析其BV的限制性取用。 结果所建细胞株均表现为CD3阳性 (98.6 %± 1 .5 % ) ,大部分细胞株 (9/ 1 1 )为CD4阳性 (97.1 %± 2 .5 % ) ,而其余 2株为CD4和CD8混合表达 ,其中CD4阳性为 82 .95 % ,CD8阳性为 36 .5 0 %。 8株分泌IFN -γ(5 44± 390 pg/ml) ,而IL - 4阴性 ,为Thl细胞 ;1株同时分泌IFN -γ和IL - 4,为Th0细胞 ;2株细胞未测出IFN -γ和IL - 4分泌 ;无Th2细胞株出现。所有T细胞株均选择性取用αβ(97.4%± 2 .4% )TCR受体。 结论所建立的rG1特异性T细胞株经表面鉴定为纯度很高的CD3阳性T细胞 ,多表现为CD4阳性 ,细胞因子分泌类型多属Th1T细胞。

HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体的构建及鉴定

目的 设计并合成人8 羟基鸟嘌呤 DNA糖苷酶(HOGG1)特异性的锤头状核酶(hammerheadribozyme)基因并构建其真核表达载体。鉴定含有核酶靶基因HOGG1cDNA保守序列的真核表达载体。方法 运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ) ,将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3 1中,重组子由BamHI和EcoRI酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。含有HOGG1基因cDNA保守序列的真核表达载体经BamHI和EcoRI酶切电泳鉴定。结果 RZ人工合成后与pcDNA 3 1连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI位点之间,命名为pcDNA 3 1 RZ。1 3kb的HOGG1基因cDNA保守序列准确克隆于pcDNA 3 1的BamHI和EcoRI酶切位点之间,命名为pcDNA 3 1 HOGG1。结论 成功合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的真核表达载体。

从健康人外周血建立人软骨抗原凝集原G1区自身反应性T淋巴细胞株

为了研究健康人T细胞库中是否存在G1特异性T细胞 ,我们应用重组人软骨抗原凝集原G1为抗原 (rG1) ,采用国际标准半有限稀释建系法 ,从 4名正常人外周血中建立了 11株rG1特异性T细胞系。 4名健康供者的rG1特异性T细胞系出现频率分别为 0 6 / 10 6(RP )、 0 5 / 10 6(AC )、 1 6 / 10 6(YZ )和 2 0 / 10 6(JY ) ,平均为 1 1± 0 5 / 10 6。远远低于类风湿性关节炎病人外周血rG1特异性自身反应性T细胞。所有T细胞系与rG1及WT和PPD共同培养以观察其特异性反应性 ,结果发现所建立的 11株T细胞系对人软骨抗原凝集素G1区具有良好的特异性。本研究结果提示正常人外周血中确有rG1特异性T细胞系 ,但是出现频率远远低于类风湿性关节炎病人 (另文报道 )。

Der p1 T细胞表位融合蛋白对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果

目的探讨重组变应原Der p1 T融合蛋白对屋尘螨粗提液诱导的哮喘小鼠特异性免疫治疗的效果。方法将30只雌性BALB/c小鼠随机均分为3组,分别为对照组、哮喘组和Der p1 T融合蛋白免疫治疗组(SIT组)。哮喘组和SIT组小鼠分别在第0、7、14天给予腹腔注射屋尘螨粗提液200μl/鼠(蛋白含量10μg/200μl),对照组小鼠注射等量PBS。哮喘组、SIT组小鼠于第21天采用屋尘螨粗提液雾化激发(蛋白浓度为0.5μg/ml),30 min/d,连续7 d,观察并记录小鼠哮喘发作情况,对照组使用等量PBS雾化激发。SIT组小鼠于第21天雾化前0.5 h,腹腔注射Der p1 T融合蛋白(100μg/ml) 200μl进行特异性免疫治疗,连续7d,对照组、哮喘组注射等量PBS。各组小鼠于末次雾化激发后24 h内取眼球血,收集血清,气管插管收集肺泡灌洗液(BALF),ELISA检测血清中特异性IgE和IgG2a抗体水平及BALF中细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4 (IL-4)、IL-10和IL-17A的含量;流式细胞仪检测脾组织中Th1/Th2和Th17/Treg细胞群落的改变;HE染色镜下观察小鼠肺组织病理形态。采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。结果各组小鼠雾化激发后,对照组小鼠仅出现短暂的轻微烦躁症状,哮喘组小鼠表现出明显的烦躁不安、喘息、呼吸加快加深,SIT组小鼠经免疫治疗后,有轻微的喘息症状,症状较哮喘组小鼠有所改善。ELISA检测结果显示,哮喘组小鼠血清中特异性IgE抗体含量为(31.49±4.32) IU/ml,高于对照组的(8.53±1.92) IU/ml和SIT组的(16.68±2.45) IU/ml (P<0.01);哮喘组小鼠血清中抗原特异性IgG2a抗体含量为(19.56±3.89)μg/ml,低于对照组的(42.43±2.07)μg/ml和SIT组的(36.96±5.04)μg/ml (P <0.01)。哮喘组小鼠IFN-γ和IL-10水平分别为(134.23±22.49)和(22.43±8.27) pg/ml,低于对照组的(212.36±33.21)和(72.84±21.42) pg/ml (P<0.05、0.01);SIT组小鼠IFN-γ和IL-10水平分别为(183.76±24.66)和(61.05±7.97) pg/ml,与哮喘组相比,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。哮喘组小鼠IL-4和IL-17A水平分别为(165.45±34.59)和(464.21±41.36) pg/ml,高于对照组的(21.31±5.26)和(115.74±30.82)μg/ml (P<0.01);SIT组小鼠IL-4和IL-17A水平分别为(64.15±17.33)和(271.61±27.07) pg/ml,与哮喘组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,哮喘组小鼠脾组织CD4^+T淋巴细胞中Th1和Treg细胞比例分别为2.8%和4.9%,较对照组的3.7%和10.3%显著降低(P<0.05、0.01);SIT组Th1和Treg细胞比例分别为3.1%和8.8%,较哮喘组小鼠的有所升高(P<0.05、0.01)。哮喘组Th2和Th17细胞比例分别为2.8%和2.2%,较对照组的1.0%和0.3%显著升高(P<0.01),SIT组Th2和Th17细胞比例分别为1.7%和0.6%,较哮喘组小鼠有所降低(P<0.01)。肺组织病理切片结果显示,哮喘组小鼠肺组织终末细支气管有明显炎性细胞浸润,支气管平滑肌纤维断裂,上皮细胞脱落;SIT组小鼠肺组织病理变化较哮喘组的有明显好转,支气管壁增厚减少,炎性细胞浸润情况得到改善。结论 Der p1T融合蛋白对哮喘小鼠的特异性免疫治疗有一定的效果。

小鼠白念珠菌抗原特异性T细胞系的建立和TH1、TH2细胞因子的产生

在念珠菌感染时，TH1细胞分泌IL-12、IFN-γ，可激活或提高中性粒细胞和巨噬细胞抗念珠菌的能力，而TH2细胞分泌的IL-4和IL-10对机体的抗念珠菌有抑制作用。T细胞产生的这些细胞因子对宿主抗念珠菌有重要意义。动物实验证实小鼠对全身和皮肤-黏膜念珠菌感染的敏感程度与其自身的TH1和TH2细胞因子的平衡密切相关。但是，鉴于这些研究之间尚存在着很多矛盾或争议的观点，例如，在小鼠实验中发现，给已感染念珠菌的小鼠注射重组IFN-γ能提高小鼠的生存能力和巨噬细胞在体外的杀念珠菌的能力。但也有实验表明，小鼠在接受了IFN-γ后，对白念珠菌的敏感性增加。我们在细胞因子研究方面仍有大量的工作要做。

短发卡样RNA抑制c-myc癌基因在乳腺癌细胞中的过度表达

目的构建人cmyc癌基因特异性短发卡样RNA(shRNA)真核表达载体,抑制靶基因cmyc在乳腺癌细胞中的过度表达。方法设计有小发夹结构的三条寡核苷酸序列,克隆至空载体pEGFPC1/U6中构建重组体并体外转染乳腺癌细胞株MCF7,48h后分别用RTPCR和Westernblot方法检测胞内cmyc癌基因mRNA水平和蛋白水平。结果①成功构建shRNA真核表达载体;②shRNA表达载体转染MCF7细胞48h后,pEGFPC1/U62能明显下调胞内cmycmRNA水平和蛋白水平(P<0.01)。结论构建的shRNA真核表达载体能显著抑制cmyc癌基因在MCF7细胞中的过表达。

他莫昔芬诱导体内外雌激素受体阳性乳腺癌细胞凋亡的周期特异性研究

目的研究他莫昔芬(TAM)诱导不同生长状态下雌激素受体阳性(ER(+))乳腺癌细胞凋亡的周期特异性并比较其差异。方法体外培养的ER(+)乳腺癌细胞株MCF-7细胞株和原代培养的ER(+)乳腺癌细胞用TAM作用后,在流式细胞仪(FCM)上用亚G1峰(sub-G1)法检测细胞凋亡率,用细胞周期特异性细胞凋亡检测法(API)检测细胞凋亡的周期特异性。结果TAM诱导不同生长状态的ER(+)乳腺癌细胞凋亡均为G0/G1期发生的周期特异性细胞凋亡,但TAM在体外诱导的乳腺癌细胞凋亡率高于在体乳腺癌细胞。结论在ER(+)乳腺癌细胞中TAM在G0/G1期特异性诱导细胞凋亡,但在不同的生长状态下,TAM诱导细胞凋亡的效率不同。

1株抗欧洲型和美洲型PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。