CHO细胞表达重组HBsAg聚合蛋白的研究

目的 :为提高重组乙肝疫苗的产量与质量 ,研究了纯化工艺最后一步凝胶过滤柱层析的重组HBsAg聚合蛋白。方法 :采用超声与DNA酶处理 ,凝胶过滤柱层析的步聚回收重组HBsAg。结果 :重组HBsAg纯化工艺的终收率从 35 %左右提高到 48%。重组乙肝疫苗的细胞免疫原性有了增强。结论 :以回收的重组HBsAg制备的重组乙肝疫苗在纯度、免疫原性和稳定性方面达到了世界卫生组织的标准。

重组HBsAg用于ELISA检测抗HBs的研究

用高纯度酵母菌基因工程重组HBsAg替代国产抗HBs ELISA试剂盒中的血源HBsAg作为包被抗原,比双抗原夹心法和BA-双抗原夹心法的敏感性均显著提高。用重组HBsAg包被的双抗原夹心法的敏感度为5IU/L。用于检测乙肝疫苗接种7个月和8个月后的婴儿血清,抗HBs转阳率分别为80.7%和92.6%。上海地区义务献血者检测结果,抗HBs阳性率为33.66%。重组HBsAg的应用有利于提高抗HBs ELISA试剂的质量。

大剂量重组HBsAg对HBV转基因小鼠细胞免疫调节作用

目的 利用免疫耐受HBV转基因小鼠动物模型研究大剂量基因重组HBsAg对其免疫调节作用 ,观察对HBV基因表达的影响。方法 比较不同免疫次数、免疫周期、免疫剂量对转基因小鼠所诱生的Th1类细胞因子和T细胞增殖的影响 ,同时检测血清中HBsAg和HBVDNA的含量。结果 多次免疫 9个月后的IL -2 ,IFNγ ,T细胞增殖的水平分别是免疫 1周时的 2 ,17,2倍 ,同时疫苗组的HBsAg的滴度在 6个月时较对照组明显降低 ,9个月时显著降低 ,HBVDNA的检测结果是疫苗组下降 10 2 的有 3只 ,而对照组没有。 9周内免疫一次和两次 ,高、中、低剂量组与对照组所诱生的IL -2水平差异均无显著性。结论 大剂量的基因重组HBsAg可以诱导出高水平的Th1类细胞因子 ,抑制HBV的基因表达 ,打破免疫耐受 。

新型佐剂及其与重组HBsAg结合物的理化性质的研究

目的 制备一种新型正电荷脂质体免疫佐剂,研究其粒径、稳定性,及其与重组乙肝表面抗原的结合率和结合物的稳定性。方法 合成DC胆固醇(DC-Chol),并采用薄膜法制备脂质体,电镜测其粒径。脂质体与HBsAg混合后高速离心,用 ELISA分别测定游离和结合的 HBsAg含量,计算HBsAg与脂质体的结合率。将 DC-Chol与HBsAg结合物免疫BALB/c小鼠,检测其抗体的滴度。结果 合成DC-Chol的产率为67％,C、H、N含量与理论含量相比,在测量误差范围内。脂质体平均粒径180mm,4℃放置10个月约产生15％的沉淀。结合物明显沉淀,上清清亮,结合率在 98％左右。初次免疫 3周脂质体组的IgG1的 A值是铝佐剂组的 6倍,IgG 2a是 14.9倍。结论本法制备的脂质体粒径小,稳定性好,与HBsAg结合率高,能有效地促进体液免疫和细胞免疫,为制备新型乙肝疫苗打下基础。

乙型肝炎病毒HBsAg重组疫苗与表面抗原DNA疫苗诱导H-2~b小鼠免疫应答的实验研究

目的:观察重组乙肝疫苗及乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原DNA疫苗接种后,C57BL/6(H-2b)小鼠的免疫应答.方法:构建质粒pVR1012-L,pVR1012-M,pVR1012-S.转染COS7细胞系进行表达.将C57BL/6小鼠分为5组,分别接种质粒pVR1012-L,pVR1012-M,pVR1012-S,pVR1012100μg及重组乙肝疫苗1μg.ELISA法检测小鼠血清抗-HBs.结果:DNA疫苗在转染细胞中可表达HBsAg.血清抗-HBs在第一次接种重组乙肝疫苗后即可检出,而在DNA疫苗组则未检出.此后重组疫苗组诱导的抗-HBs的滴度与DNA疫苗组相似.结论:HBV表面抗原DNA疫苗在H-2b小鼠试验中有体液免疫原性.

疏水层析用于纯化重组乙肝表面抗原的研究

目的提高重组乙肝表面抗原(HBsAg)的纯化效率.方法用HBsAg基因重组质粒转化中华地鼠卵巢细胞,经克隆筛选的C28细胞系作为基因工程乙肝疫苗株[1],培养重组CHO-C28工程细胞,收集含HBsAg的细胞原液,经连续离心(15000r/min)除细胞碎片,超滤浓缩后研究不同盐浓度下,疏水介质对于重组HB8Ag的吸附及纯化的影响.结果硫酸铵饱和度为4%、6%时,盐浓度太低,HBsAg未能很好地结合到疏水介质上;硫酸铵饱和度为10%时,疏水性太强,HBsAg不宜从介质上洗脱下来.结论8%饱和度的硫酸铵更适合重组HB8A g的纯化.

重组抗HBsAg单链抗体在HBV转基因小鼠体内作用的研究

目的 研究重组人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)在HBV转基因小鼠体内的活性作用 ,探讨HBV转基因小鼠作为HBsAg特异性抗体的结合活性评价模型的可行性。方法 工程菌表达的HBscFv包涵体经固定化金属螯合层析和分子排阻层析两步纯化后 ,分步透析复性。复性后的HBscFv(0 .9g L)经尾静脉注射HBV转基因小鼠 ,一定时间后测定鼠血清中HBsAg的浓度 ,计算抗体注射前后HBsAg浓度下降的百分比 (结合率 ) ,同时以人血源HBsAbIgG(40U ml)和生理盐水作为对照。结果 两步纯化获得纯度达到 98%的重组HBscFv。HBscFv制品能够结合转基因小鼠体内的HBsAg,其结合率为 (30 .4 7± 9.85 ) % ,与生理盐水组差异有显著性 (P <0 .0 0 1) ,与HBsAbIgG组差异无显著性(P >0 .0 5 ) ;对照品HBsAbIgG的结合率为 (39.0 0± 7.4 3) % ,与生理盐水组差异也有显著性 (P <0 .0 0 1)。比较HBscFv和HBsAbIgG的结合率及其浓度 ,求得HBscFv的结合效价为 31.5 8U mg。结论 HBscFv在转基因小鼠体内具有特异性结合HBsAg活性 ,HBV转基因小鼠可发展为评价HBsAg特异性抗体的体内结合活性的候选模型。

乙型肝炎表面抗原不同突变体对细胞免疫的影响

目的 研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)不同突变体对细胞免疫的影响。方法 将野生型和变异型HBsAg基因重组质粒NS2 Swt、NS2 S12 6、NS2 S133、NS2 S14 1、NS2 S14 5分别转染CHO细胞,72h收获细胞上清。采用ELISA法检测各组细胞上清preS2 蛋白的表达量。将这些细胞上清刺激PHA活化的人淋巴细胞,MTS法检测不同变异株抗原对淋巴细胞增殖活性以及淋巴细胞分泌IFN γ、IL 10和IL 2的影响。结果 变异和野毒株(wt)各组细胞上清preS2 蛋白的表达量基本一致。变异和wt重组HBsAg刺激T细胞后,其上清MTS显色后的A4 90 值均高于空白组和pCI neo组,说明HBsAg中的蛋白可以促进T细胞增殖;T12 6S氨基酸变异HBsAg能够刺激IFN γ分泌增加;M133T氨基酸变异刺激IL 10分泌增加。结论 这4种乙型肝炎病毒(HBV)变异株感染人体后,机体对它们的细胞免疫反应可能不会有明显的增强或减弱,但也不能忽视T12 6S和M133T变异抗原改变了某些细胞因子的表达,可能对机体细胞免疫造成的潜在影响。