人白介素24重组蛋白的表达及其抗肿瘤机理的研究

将人白细胞介素24(hIL24)的cDNA序列克隆至原核高效表达载体pET21a(+)上,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获高效表达,经纯化、复性后的rhIL24蛋白具有抑制HeLa细胞生长,诱导HeLa细胞凋亡,刺激外周血单核细胞分泌IL6、TNFα、IFNr,抑制血管形成的功能。初探了rhIL24蛋白能通过下调抗凋亡因子bcl2表达,激活线粒体凋亡途径引起肿瘤细胞凋亡的机理。

新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的表达优化及下游纯化

目的优化提高重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白在原核细胞中的表达量,并建立有效的下游纯化路线。方法对IL6D24-PE40KDEL的受体菌、菌体生长状态及诱导表达时间等进行优化,经反复筛选确定了高效简捷的纯化路线:即将Q型强离子交换树脂与DEAE弱离子交换树脂相结合的两步纯化法。结果宿主工程菌HB101的优化表达条件为2%接种量,30℃培养3h,42℃再诱导4h,可使目标蛋白的表达量由最初的13.5%提高到23.8%;经12%SDS-PAGE蛋白电泳证实,特异性表达产物为包涵体形式,占包涵体蛋白的40%,分子量约为60kD,与所预测的IL6D24-PE40KDEL融合蛋白的分子量相吻合。两步纯化法可获得纯度>95%的IL6D24-PE40KDEL融合蛋白,纯化蛋白的回收率为8.7%,经Western-blot实验证明,它可同PEA多抗和IL6单抗特异性的结合。MTT试验检测证实,该融合蛋白能特异性的杀伤高表达IL6R的U266多发性骨髓瘤细胞,ID50为180ng/ml;而对IL6R的T淋巴白血病细胞CEM则无杀伤,ID50>1000ng/ml。结论获得了高表达重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的菌株并建立了高效简捷的下游纯化路线,融合蛋白能特异性的杀伤表达IL6R的多发性骨髓瘤细胞系U266。

抗HIV-p24单克隆抗体细胞株的建立及初步应用

拟建立抗HIV-p24蛋白的单克隆抗体细胞株及双抗体夹心法,用于检测艾滋病病人血清中的p24抗原。用纯化的基因工程表达的HIV-p24蛋白免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,有限稀释法克隆细胞,ELISA筛选特异性抗体。结果克隆筛选出12株细胞,初步建立了检测HIV-p24抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验。本方法为监控艾滋病病毒感染的窗口期和艾滋病病人临床治疗效果提供了检测手段。

重组病毒巨噬细胞炎性蛋白对HIV-1_(SF1)的体外抑制作用

目的:研究重组病毒巨噬细胞炎性蛋白(rvMIP)体外的抗HIV-1SF1作用效果和机制。方法:分别在HIV-1SF1接种前后将敏感的MT-4细胞系与rvMIP作用,检测MT-4细胞系病变情况和培养上清的P24抗原水平,用有限稀释PCR法测定前病毒DNA水平。结果:预先用rvMIP处理过的细胞,病毒感染后细胞病变程度很轻,培养上清的P24抗原和前病毒水平明显低于对照组,P24抗原抑制率可达90%;先感染病毒再用rvMIP处理组病毒P24抗原水平和细胞内前病毒DNA水平也显著降低,但降低程度不如先用rvMIP预处理组。结论:rvMIP能阻止病毒进入靶细胞,同时可能也通过某种机制抑制已感染细胞HIV病毒的复制。

巯基丁二胺铜单层修饰金电极上HIV-p24抗原的电化学免疫检测

制备了用巯基丁二胺铜(CuL)修饰的金电极并用作HIV-p24抗原蛋白(简称p24)免疫检测的化学传感器。CuL通过单层自组装固定在金电极表面,其覆盖率为1.02×10-11mol.cm-2,在含有1.0 mmol.L-1过氧化氢并在pH 6.2的磷酸盐缓冲溶液中,制备的校正曲线的线性范围为0.5-150μg.L-1p24对相应的伏安响应,方法的检出限为0.2μg.L-1。在10μg.L-1p24浓度水平作精密度试验,得RSD值为3.5%,于试样中分别加入5,15,20及30μg.L-1p24进行回收率试验,所得结果在98%-102%之间。此方法毋需另加电子传递媒介体。应用此方法于临床血清分析,所得结果与放射性免疫法的结果一致,且所得RSD值均小于0.3%。

弓形虫P24基因细胞内定位载体重组质粒的构建

目的 构建编码弓形虫 RH株 P2 4基因的细胞内定位载体并进行其序列测定。 方法 弓形虫 RH株腹腔接种小鼠 ,收集腹水 ,Trizol试剂盒抽提基因组 RNA;根据基因库 P2 4基因序列设计合成引物 ,采用 RT- PCR法扩增编码P2 4的基因片段 ,经低熔点琼脂糖法回收并纯化 ;将 P2 4基因定向克隆到细胞内定位载体 p CMV/ myc系列 :p CMV/myc/ cyto(胞质定位 )、p CMV/ myc/ nuc(核定位 )、p CMV/ myc/ mito(线粒体定位 )及 p CMV/ myc/ ER(内质网定位 )。转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞 ,在氨苄青霉素阳性 L B培养基平板上筛选出阳性克隆。重组子经双酶切 ,PCR鉴定 ,最后对重组子进行序列测定。 结果 RT- PCR方法从弓形虫 RH株扩增 5 72 bp的 P2 4基因片段 ,分别构建重组质粒p CMV/ myc/ cyto- P2 4、p CMV/ myc/ nuc- P2 4、p CMV/ myc/ mito- P2 4和 p CMV/ myc/ ER- P2 4 ,酶切和 PCR鉴定产物大小与预期值相符合 ,序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码 P2 4抗原的基因片段。 结论 成功构建编码弓形虫表面抗原 P2 4基因真核细胞内定位载体重组质粒 p CMV/ myc/ cyto- P2 4、p CMV/ myc/ nuc- P2 4、p CMV/ myc/ mito- P2 4和p CMV/ myc/ ER- P2

人免疫缺陷病毒I型 p24gag 基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。

腺病毒重组人白细胞介素24对肾癌细胞株786-O细胞生长和凋亡的影响

目的探讨腺病毒重组人白细胞介素24(IL-24)对肾癌细胞株786-O细胞的生长和凋亡的影响。方法将培养的肾癌细胞株786-O细胞随机分为空白对照组、阴性对照组(转染腺病毒重组人IL-24对照组)及实验组(转染腺病毒重组人IL-24组)。取对数生长期肾癌细胞株786-O,构建腺病毒重组人IL-24及对照并转染至肾癌细胞株786-O实验组细胞及阴性对照组细胞。使用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测肾癌细胞株786-O生长能力;采用流式细胞术检测肾癌细胞株786-O凋亡情况;应用Western Blot检测肾癌细胞株786-O中MMP-9蛋白的表达水平。结果实验组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞表面磷脂酰丝氨酸表达水平高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞中MMP-9蛋白表达水平低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸表达水平、MMP-9蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染腺病毒重组人IL-24可抑制肾癌细胞株786-O细胞的生长并诱导细胞凋亡,腺病毒重组人IL-24可能通过下调MMP-9诱导肾癌细胞株786-O细胞的凋亡。

黄芪注射液联合精蛋白锌重组赖脯胰岛素综合治疗早期糖尿病肾病随机平行对照研究

[目的]观察黄芪注射液联合精蛋白锌重组赖脯胰岛素综合治疗早期糖尿病肾病疗效。[方法]使用随机平行对照方法,将120例住院患者按随机数字表方法随机分为两组,饮食指导、运动干预,控制血脂。对照组60例精蛋白锌重组赖脯胰岛素,胰岛素泵皮下注射给药,0.5~0.8U/kg·d^(-1),胰岛素全天给药量40%为基础量,60%为餐前剂量,早餐及晚餐前给药。治疗组60例黄芪注射液30mL+100mL生理盐水,静滴,1次/d;精蛋白锌重组赖脯胰岛素治疗同对照组。连续治疗7d为1疗程。观测临床表现、24h尿微量白蛋白、尿β2微球蛋白、微量白蛋白/尿肌酐、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶、糖化白蛋白、血清胱抑素C、不良反应。连续治疗1疗程(21d),判定疗效。[结果]GA、Cys-C、mALB、UACR、Uβ2MG、NAG两组均有改善(P<0.01),治疗组改善优于对照组(P<0.05,P<0.01)。[结论]黄芪注射液联合精蛋白锌重组赖脯胰岛素综合治疗早期糖尿病肾病,疗效满意,无严重不良反应,值得推广。

新型重组IL-6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白复性及纯化

目的 :对高效表达的重组IL 6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白进行包涵体的分离、变性与复性以及纯化。方法 :对表达菌体进行超声破碎、洗涤、氧化还原法变性及复性 ,经离子交换层析。结果 :工程菌HB10 1/ pE0 1T的表达产物是以包涵体形式存在 ,菌体的破碎以高渗蔗糖溶液进行预处理后 ,再超声破碎效果最好 ;包涵体的洗涤则先用Triton X 10 0洗 2次 ,再用 8mol/L尿素洗涤一次效果更优 ;最佳变性条件为在 7mol/L盐酸胍中加入0 .0 6 5mmol/L的DTT和 0 .2mol/L的盐酸精氨酸 ;最佳复性条件为在 10℃复性保持 2 4h ,蛋白浓度保持在 30～80 μg/ml,并需加入 0 .2mol/L盐酸精氨酸 ;利用谷胱甘肽的氧化还原法 ,当氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽的浓度比在 2∶1时所获得的活性成分得率最高 ;利用强弱离子交换结合的方法能获得纯度为 95 %的目的蛋白 ,所得融合蛋白可与IL 6及PEA抗体相结合并能特异性地杀伤高表达IL 6R的人多发性骨髓瘤细胞。结论 :本研究获得重组IL 6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白包涵体的分离、变性与复性条件和一条能获得大量高纯度该融合蛋白的纯化路线。

TRAIL_(114～281)-IL-24融合蛋白的原核表达及其体外抗肿瘤细胞活性

目的原核表达肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)114～281肽和人白细胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)融合蛋白,并检测其体外抗肿瘤细胞活性。方法以人外周血单个核细胞总RNA为模板,PCR扩增TRAIL114～281和IL-24基因,经T4DNA连接酶连接成融合基因,克隆至pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a/TRAIL114～281-IL-24,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白TI经层析法纯化后,进行Western blot分析,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,caspase3活性检测试剂盒检测其对不同肿瘤细胞caspase3活性的影响。结果重组表达质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;TI融合蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度可达95%,且可与鼠抗人IL-24抗体发生特异性反应;经复性的蛋白能明显抑制人宫颈癌上皮细胞HeLa和人乳腺癌细胞MCF-7增殖,并显著提高肿瘤细胞的caspase3活性。结论已在大肠杆菌中表达了TRAIL114～281-IL-24融合蛋白,其具有诱导部分肿瘤细胞凋亡的活性。

HIV-1 p24和gp41融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化

目的用基因重组技术将HIV-1 p24基因以及gp41基因具有抗原线性中和表位的部分重组连接,构建重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法设计带有酶切位点的引物,分别PCR扩增p24和gp41两个基因,将它们分别连接到pMD18-T载体中,测序验证后,挑选出含有目的基因的正确克隆。将p24片段酶切后连接到gp41基因所在的pMD18-T载体中,再将连接后的两个基因酶切,重新连接到pET21a表达载体中。将表达载体转染大肠埃希菌诱导表达,经Western-blot验证表达正确。结果融合蛋白p24-gp41在大肠埃希菌中高效表达。结论融合蛋白p24-gp41可以在pET21a表达载体中高效表达。

以发热、蛋白尿为首发症状的原发性肾淋巴瘤一例

患者女,42岁.因低热伴间断恶心、呕吐1个月入院,体温37.0～38.0℃,不规则热型,无肉眼血尿、尿频、尿急,无胸闷、腹痛、腹胀,无皮疹、关节疼痛.体检：体温37.3℃,全身浅表淋巴结未触及,心肺听诊未见异常,肝脾肋下未触及,双肾区叩击痛阳性,输尿管走行区无压痛、反跳痛.实验室检查：尿常规：尿蛋白（＋＋）,24h尿蛋白定量0.44g;血常规：WBC 9.70×109/L,RBC 2.72×1012/L,Hb 89.0 g/L,PLT 117×109/L,淋巴细胞5.8×109/L;C反应蛋白42.59mg/L,ESR 61 mm/1h;血生化：乳酸脱氢酶1 763 U/L,碱性磷酸酶71 U/L,余生化检查未见异常.腹部彩色超声：双肾体积弥漫性增大,左肾136 mm ×63 mm ×54 mm,右肾133 mm ×62 mm ×53 mm.腹部CT平扫：双肾体积增大,腹膜后未见明显肿大淋巴结影.行肾穿刺活检术,病理示：肾小管可见上皮细胞空泡、颗粒变性;肾间质弥漫形态大小较为均一的单个核细胞浸润;小动脉未见明显异常（图1、2）;免疫组化：CD99（图3）、CD43、CD79a（图4）、Bcl-6（图5）、Ki-67（图6）、MUM-1阳性,CD3、CK、CD20、Syn、CgA、CD56、WT-1、S100阴性.诊断意见：符合非霍奇金淋巴瘤（NHL）（右侧肾脏）,根据淋巴组织肿瘤WHO（2001）分型,为弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）.骨髓穿刺提示骨髓增生活跃,未见异常细胞增生.诊断：原发性肾淋巴瘤（PRL）.给予环磷酰胺（1.10 g）＋吡柔比星（70 mg）＋长春新碱（2 mg）＋泼尼松（100 mg） （CHOP）方案化疗,患者于化疗第一个疗程出现Ⅳ度骨髓抑制及肺部感染,合并呼吸衰竭、呕吐,给予重组人粒细胞刺激因子、重组人血小板生成素、重组人IL-11升白细胞、血小板,卡洛磺钠止血,替考拉宁、比阿培南抗感染,氨溴索化痰,阿扎司琼止吐,甘露醇降颅压,复方甘草酸苷护肝及对症支持治疗,效果欠佳,于确诊PRL 1个月后死于肺部感染.

重组腺病毒介导金黄色葡萄球菌肠毒素A基因在小鼠B16黑素瘤细胞中的表达

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因通过重组腺病毒介导转染入B16黑素瘤细胞中的表达情况。方法用RT-PCR和流式细胞仪检测SEA基因在B16黑素瘤细胞中的表达。结果在转染SEA基因的B16黑素瘤细胞中检测到SEA基因的转录,并于转染后24h开始有SEA蛋白的表达,到72h表达量达最高值87.22,之后减弱,直到168h仍有少许表达。结论SEA基因可以在B16黑素瘤细胞中表达,为下一步黑素瘤的基因治疗奠定基础。

miR-24-3p通过Keap1/Nrf2信号途径减轻糖尿病肾病大鼠的炎性反应和肾损伤的作用与机制研究

目的探讨miR-24-3p通过重组Kelch样ECH关联蛋白1(recombinant Kelch like ECH associated protein 1,Keap1)/核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)信号途径减轻糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)大鼠的炎性反应和肾损伤的作用与机制。方法60只SD大鼠随机分为对照组、模型组(DN组)、miR-24-3p阴性对照组(DN+miR-NC组)和miR-24-3p模拟物组(DN+miR-24-3p模拟物组),每组15只。实时定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)检测各组大鼠肾脏组织中miR-24-3p的表达;血糖仪测定各组大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose,FBG);双缩脲法测定各组大鼠24 h尿蛋白水平;全自动生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐(creatinine,Cr)和血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察各组大鼠肾脏组织病理变化;马松(Masson)染色观察各组大鼠肾脏组织纤维化;酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠血清中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)的表达;免疫组织化学法检测各组大鼠肾脏组织中转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的表达;生物信息学工具预测靶基因;双荧光素酶报告基因检测基因或蛋白之间的相互作用;蛋白质免疫印迹(Western blot)检测各组大鼠肾脏组织中Keap1和Nrf2蛋白的表达。结果DN组和DN+miR-NC组大鼠肾脏组织中miR-24-3p的表达下调(P<0.001),DN+miR-24-3p模拟物组大鼠肾脏组织中miR-24-3p的表达显著上调(P<0.001)。与DN组和DN+miR-NC组比较,miR-24-3p模拟物组大鼠的FBG下降(P<0.05),24 h尿蛋白量下降(P<0.05),血清Cr、BUN水平下调(P<0.05)。DN+miR-24-3p模拟物组大鼠肾脏组织中可见规则的肾小球,肾小管轻度浮肿,肾间质中的炎性细胞浸润减少,胶原纤维沉积减少。miR-24-3p模拟物组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的水平下调(P<0.05),大鼠肾脏组织中TGF-β1的表达水平下降(P<0.05)。miR-24-3p与Keap1存在靶向关系;miR-24-3p模拟物组大鼠肾脏组织中Keap1蛋白表达下调(P<0.05),Nrf2蛋白表达上调(P<0.05)。结论miR-24-3p在DN大鼠肾组织中表达降低,过表达miR-24-3p对DN大鼠的肾脏组织有保护作用,可能与降低肾脏组织的炎症因子水平、TGF-β1蛋白表达和Keap1/Nrf2通路有关。