利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP两种抗原在检测宫颈癌抗 16L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别 ,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长15 35bp的HPV16L1基因片段 ,克隆至 pUC18 T载体中 ,进行DNA测序鉴定。然后 ,将HPV16L1基因克隆至pGEX 2T表达载体中 ,并诱导表达HPV16L1融合蛋白 ,分子量为 83kD ,能被HPV16L1单克隆抗体所识别。经GST柱层析法纯化后 ,与重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP分别经酶联免疫吸附 (ELISA)法检测 12份宫颈癌患者和 35份献血员血清。 12例宫颈癌血清标本中 ,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为 7例 (占 5 8.3% ) ;抗HPV16L1 VLP的抗体阳性率为 8例 (占 6 6 .7% )。经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体IgG(+)的 7份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测均阳性 ;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体IgG( )的 5份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测有 1份阳性。两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异 (P >0 .0 5 )。本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关 ,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1 VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响。利用重组抗原HPV16L1对宫颈癌的抗体进行定性。

HPV_(16)L1-E7重组腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒16型L1-E7重组腺病毒载体疫苗的免疫效应。方法:①将rAd5HPV16L1-E7载体疫苗在293细胞中扩增后,以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠,采用ELISA法测其血清IgG抗体水平;②制备脾细胞悬液,加入到96孔无菌培养板中,并分别加入rAd5HPV16L1-E7特异性蛋白和RPMI1640+10%胎牛血清,加入3H-TdR1μCi/孔,做T-细胞增殖实验;③取经过培养56h的培养液进行IFN-γ的测定。结果:不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组(P<0.05),但以肌注组产生抗体量最多,IFN-γ和T-细胞增殖亦高于对照组(P<0.05)。结论:rAd5HPV16L1-E7重组活病毒疫苗既能刺激T-细胞产生细胞介导的免疫应答,又能刺激B-细胞产生抗体介导的免疫应答,说明其具有很好的免疫原性。

HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定

目的 HPV16L1重组蛋白的表达为研制HPV16L1预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础。方法 pPIC3 5 HPV16L1 GS115阳性菌株 ,经 0 5 %甲醇诱导 ,运用SDS PAGE电泳检测L1蛋白 ;用鼠抗HPV16L1单克隆抗体 ,经WesternBlotting检测蛋白的特异性 ;在透射电镜下观察类病毒颗粒 (VLPs)。结果 SDS PAGE检测结果表明 ,在5 5KD处有诱导蛋白带的出现 ;经WesternBlotting验证 ,该蛋白能与HPV16L1单克隆抗体特异结合 ,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白 ;电镜下见到了直径约为 5 0nm、形态结构与天然病毒颗粒极其相似的VLPs。结论 pAIC3 5 HPV16L1重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生HPV16L1晚期蛋白 ,该蛋白在酵母菌中可自我组装成VLPs。

阴道镜检查联合HPV L1壳蛋白、p16蛋白检测筛查宫颈上皮内瘤变效果

目的:探讨宫颈病变筛查中阴道镜检查、人乳头瘤病毒L1(HPV L1)壳蛋白检测、多肿瘤抑制基因(MTS1,p16蛋白)检测和联合诊断在宫颈上皮内瘤变(CIN)的临床应用效果。方法:收集2022年6月-2023年6月本院妇科门诊因疑存宫颈病变进行宫颈癌筛查的女性201例,均行HPV L1壳蛋白、p16蛋白检测和阴道镜检查,以阴道镜下宫颈组织活检病理结果为诊断依据,对HPV L1壳蛋白、p16蛋白检测、阴道镜检查及3项联合诊断的效果进行分析。结果:宫颈病理诊断无病变121例,病变80例(CIN1级54例、CIN2级25例、CIN3级1例)。阴道镜CIN检出率为53.7%,灵敏度81.3%,特异度64.5%,准确度为71.1%;HPV L1壳蛋白检测CIN检出率为55.2%,灵敏度73.8%,特异度为57.0%,精确度为63.7%。p16蛋白检测CIN检出率为53.7%,灵敏度83.8%,特异度66.1%,精确度73.1%。3项联合检测CIN检出率为64.2%,灵敏度97.5%,特异度57.9%,精确度74.6%。筛查灵敏度阴道镜、HPV L1壳蛋白、p16蛋白检测无差异(χ^(2)=2.667,P>0.05),但3项联合诊断的灵敏度高于各单独指标检测(χ^(2)=11.123、18.331、8.901,P<0.05),特异度3项联合诊断与单独指标无差异(χ^(2)=3.233,P>0.05)。结论:阴道镜检查联合HPV L1壳蛋白,p16蛋白检测筛查CIN的灵敏度可显著提高,可为临床提供有价值的诊断证据。

HPV16L1抗原表达肿瘤模型的建立

应用基因重组技术,构建pcDNA-L1真核表达载体,经限制性内切酶和序列分析,用脂质体转染技术将其转入B16细胞,G418稳定筛选后IFA法检测其表达,RT-PCR法检测HPV16L1 mRNA 的生成,并将转染细胞接种小鼠皮下,观察成瘤情况及RT-PCR法检测HPv16L1 mRNA的生成。结果,酶切鉴定证实重组质粒中插入的目的基因片段及载体大小、方向和插入位点均正确,在转染的 B16细胞中可见绿色荧光并检测到HPV16L1 mRNA的生成,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤, 接种后1月在肿瘤组织中可检测到HPV16L1 mRNA的生成,B16细胞转染L1后其致瘤性与转染空载体组和野生型B16细胞组无明显差异。

子宫颈病变中HPV L1蛋白和p16的表达

目的研究HPV L1蛋白和p16在子宫颈各种病变中的表达情况,探讨它们在子宫颈病变进展中的预测价值。方法应用免疫组化方法检测41例各种子宫颈病变(CIN1级18例、CIN2级9例、CIN3级8例和浸润性鳞状细胞癌6例)中HPV L1蛋白和p16的表达。结果HPV L1蛋白在各种子宫颈病变中的阳性率为26.8%。其中HPV L1在CIN1中的阳性表达率为38.9%,CIN2为44.4%,CIN3和浸润性鳞状细胞癌均无表达。p16在各种子宫颈病变中的阳性率为68.3%,其在CIN1中的阳性表达率为38.9%,CIN2为77.8%,CIN3和浸润性鳞状细胞癌均表达阳性。100%CIN3和浸润性鳞状细胞癌为p16+/HPV L1-,而61.1%CIN1中为p16-/HPV L1+或p16-/HPV L1-。结论随着子宫颈病变的进展,HPV L1阳性表达率降低而p16阳性表达率增高。p16+/HPV L1-提示子宫颈鳞状上皮内瘤变有进展的可能,而p16-/HPV L1+和p16-/HPV L1-可能为无进展的或潜在消退的子宫颈病变。

HPV-16 L1甲基化和HPV E6/E7 mRNA检测宫颈病变的临床价值

目的:探讨HPV-16 L1甲基化程度、HPV E6/E7 mRNA表达水平在检测宫颈病变中的临床价值。方法:选择50例HPV-16感染患者的宫颈脱落细胞学标本,其中CIN1 11例、CIN2 11例、CIN3 21例、宫颈鳞癌(SCC)7例,另取11例病理检测HPV-16阴性或慢性炎症者为对照。采用甲基化敏感性高分辨溶解曲线法检测HPV-16 L1甲基化水平,采用b DNA技术检测HPV E6/E7 mRNA的表达情况。结果:对照组、CIN1组、CIN2组、CIN3组和SCC组HPV-16 L1甲基化阳性率分别为9.1%、72.7%、81.8%、90.5%、100.0%,HPV E6/E7 mRNA阳性率分别为45.5%、72.7%、90.9%、100.0%、100.0%;CIN2以上病变中HPV-16 L1甲基化阳性率均高于对照组,而CIN3以上病变中HPV E6/E7 mRNA阳性率均高于对照组(P均<0.005)。HPV-16 L1甲基化程度和HPV E6/E7 mRNA水平均随宫颈病变严重程度的增加而升高(rS=0.638和0.525,P均<0.001);HPV-16 L1甲基化程度与HPV E6/E7mRNA表达水平呈正相关(rS=0.420,P=0.001)。结论:HPV-16 L1甲基化与HPV E6/E7 mRNA检测在分流HPV感染或细胞学阳性患者方面具有良好的临床应用前景。

原核表达系统中HPV16L1蛋白的表达与纯化

为了建立 HPV16 L1蛋白原核表达系统的纯化方法 ,纯化目的蛋白 ,我们构建了 p GEX4 T- HPV16 L1表达质粒。在大肠杆菌 BL2 1表达系统中表达 ,经过包涵体提取 ,8M尿素溶解 ,分级透析除去尿素 ,亲和层析进行提纯。结果显示 ,HPV16 L1蛋白在原核表达系统以不溶性包涵体形式存在 ,通过本方法可以获得纯化的 HPV16 L1蛋白 ,为 HPV16

HPV 16L1基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建HPV16L1基因的原核表达质粒,并优化其表达条件。方法:根据GeneBank中的HPV序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物,以含有HPV全长基因片段重组质粒为模板,经PCR扩增出1 500 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆。其扩增片段测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pGEX-KG-HPV16L1已构建成功。提取pGEX-KG-HPV16L1质粒转化到BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体,进行SDS-PAGE,Western Blot鉴定。结果:在大肠杆菌中获得HPV16L1基因融合表达,融合蛋白的相对分子量为83kDa;表达的蛋白能与抗HPV16L1抗体发生特异性反应。结论:HPV16L1基因在大肠杆菌中获得高效表达,为HPV16L1疫苗的研制奠定了基础。

宫颈癌组织中HPV16L1蛋白质的表达及意义

为探讨人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)16 L1蛋白表达与宫颈癌发生与发展的关系,为防治宫颈癌奠定基础。采用收集宫颈癌患者48例、宫颈上皮内瘤样病变(cervcal intraepithelial neoplasia,CIN)患者41例和慢性宫颈炎患者30例石蜡组织标本用于免疫组织化学实验的方法。检测HPV16 L1蛋白在宫颈癌组织、CIN组织和慢性宫颈炎组织中的蛋白质表达状况。HPV16 L1蛋白质免疫组织化学实验的结果显示,慢性宫颈炎组织中阳性率为100%,而在宫颈癌组织中阳性率仅为27.1%,差异有统计学意义(P<0.01)。慢性宫颈炎组织的阳性率明显高于宫颈癌组织。由此可知,HPV16 L1蛋白质在宫颈原位癌开始表达减少,宫颈浸润癌表达减少更明显,可能可以用于诊断CINⅡ和CINⅢ或CINⅡ和宫颈癌。

P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白检测在宫颈鳞状上皮内病变诊断中的应用

目的初步探讨P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白检测在宫颈鳞状上皮内病变诊断中的应用价值。方法选择在温州市人民医院就诊患者,收集69例宫颈鳞状上皮内病变标本,行P16^(INK4A)、HPV L1壳蛋白检测,分析P16^(INK4A)、HPV L1壳蛋白及P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白在各级宫颈病变中的表达差异。结果 P16^(INK4A)在LSIL组、HSIL组、SCC组中的阳性率分别为45.5%、85.2%、100.0%。同LSIL组比较,P16INK4A在HSIL组及SCC组阳性率明显升高(P<0.01)。HPV L1壳蛋白在LSIL组、HSIL组、SCC组中的阳性率分别为63.6%、18.5%、0%,HPV L1壳蛋白在LSIL组中阳性率明显低于HSIL组及SCC组(P<0.01)。随着宫颈病变加重,P16+/L1-阳性率有升高趋势(P<0.01),P16-/L1+阳性率有下降趋势(P<0.01)。LSIL组中P16+/L1-阳性率明显低于HSIL组和SCC组(P<0.01),SCC组P16+/L1-阳性率较HSIL组有明显提高(P<0.05)。LSIL组中P16-/L1+阳性率明显低于HSIL组和SCC组(P<0.01)。P16+/L1-较P16^(INK4)、HPV L1壳蛋白单一检测筛查HSIL+特异性明显升高(P<0.01)。结论 P16^(INK4A)联合HPV L1壳蛋白有望成为诊断宫颈鳞状上皮内病变的有效指标。

型特异性、构象依赖性HPV16 L1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:研制具有型特异性和构象依赖性的人乳头瘤病毒16主衣壳L1蛋白(HPV16 L1)单克隆抗体(mAb)。方法:利用昆虫-杆状病毒系统表达有生物活性的HPV16 L1蛋白。非变性条件下纯化HPV16 L1蛋白,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠。末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆。非变性Western blot鉴定mAb的型特异性和构象依赖性,细胞免疫组化确定抗体的型特异性。间接ELISA法测定杂交瘤分泌上清及腹水中抗体效价。mAb亚类试剂盒鉴定mAb亚类。结果:获得1株稳定分泌具有型特异性和构象依赖性的HPV16 L1抗体的杂交瘤细胞株,命名为2E3。2E3杂交瘤细胞株细胞培养上清中抗体效价为1∶800;小鼠腹水中抗体效价为1∶12800。亚类鉴定结果为IgG1κ。Western blot及细胞免疫组化分析结果显示,2E3mAb具有型特异性和构象依赖性,只与非变性的HPV16L1蛋白发生反应,不与HPV18L1、HPV58L1、HPV11L1产生交叉反应。结论:成功制备了型特异性HPV16 L1 mAb,为进一步研究HPV16 L1的抗原表位奠定了基础。

基于抗原表位分析的人乳头瘤病毒16L1壳蛋白基因克隆及表达纯化

目的：选择人乳头瘤病毒（HPV）16L1抗原性最强的一段抗原表位编码区,构建原核表达载体并利用大肠杆菌表达抗原蛋白,为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。方法：借助DNAstar软件分析HPV16L1的CDS区,选择抗原性最强的一段抗原表位编码区,提取HPV16L1编码区的DNA。目的 DNA和p ET32a质粒分别进行双酶切,连接并转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆后转化BL21大肠杆菌,诱导产生HPV16L1重组蛋白,通过市售抗体对重组蛋白的抗原特异性进行鉴定。结果：利用DNAstar软件,选择了抗原表位较富集的碱基序列919~1314bp区段,按常规制备重组蛋白的方法成功制备HPV16L1重组蛋白。抗体鉴定表明,制备的重组蛋白抗原特异性良好。结论：有针对性地制备HPV16L1重组蛋白,可避免其他抗原表位的干扰。经鉴定,HPV16L1重组蛋白抗原特异性良好,将为HPV疫苗的研究及宫颈癌的诊断奠定基础。

HPV16 L1蛋白在原核表达系统中的表达与纯化

目的 建立HPV16L1蛋白原核表达系统的纯化方法 ,纯化目的蛋白。方法 构建pGEX4T HPV16L1表达质粒。在大肠杆菌BL2 1表达系统中表达 ,经过包涵体提取 ,8mol/L尿素溶解 ,分级透析除去尿素 ,亲和层析进行提纯。结果 HPV16L1蛋白在原核表达系统以不溶性包涵体形式存在 ,通过本方法可以获得纯化的蛋白。结论 建立了一套纯化HPV16L1蛋白的方法。

HPV16L_1晚期基因诱导表达的实验研究

目的 :可为HPV16L1重组蛋白疫苗及诊断试剂盒的研制打下基础。方法 :含有HPV16L1pPIC3.5重组质粒的GS115阳性菌株 ,经甲醇诱导在甲醇营养型酵母菌中表达HPV16L1蛋白 ,经SDS PAGE电泳 ,对所表达蛋白进行分析、鉴定。结果 :HPV16L1 pPIC3.5重组质粒经甲醇诱导产生 5 5KD大小的L1靶蛋白 ,经SDS PAGE电泳表明 ,诱导第四天L1蛋白表达量最大。结论 :甲醇可诱导HPV16L1靶蛋白的表达 ,并且在第四天表达量最大。

地方株HPV16L1基因诱发的小鼠体液免疫反应

目的检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因疫苗诱导的体液免疫反应。方法采用PCR技术从宫颈癌组织中获得L1基因,以pGEM-T Easy为克隆载体构建重组质粒 pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体 pcDNA3．1(-)中,构建地方株HPV16L1基因疫苗,转染COS-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达。用pcDNA-L1肌肉内注射方法分别于第1天、第15天和第43天免疫6周龄BABL/c小鼠, 在特定时间段采血分离血清,IFA分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答,设pcDNA载体对照。结果 pcDNA-L1能够在COS-7细胞中暂态表达,免疫小鼠后能检测出特异的抗体,用IFA方法在第一次免疫后的第30、60和180天均可检测到抗体;原载体免疫后未检出特异抗体。结论本实验构建的地方株HPV16L1基因疫苗可诱导产生特异性的体液免疫反应。

HPV L1壳蛋白与P16蛋白联合检测在宫颈癌前病变中的临床意义

目的研究HPV L1壳蛋白与P16蛋白联合运用在宫颈癌前病变诊断中的临床意义及对转归的预测价值。方法对208例TCT异常且HR-HPV阳性的患者进行宫颈活检并根据病理结果分组,同时检测其HPV L1壳蛋白和P16蛋白并根据两种抗体表达情况分为4组,并对其中随访到的155例患者进行HPV转阴分析。结果HPV L1壳蛋白和P16蛋白在不同级别宫颈组织中的表达均不同,CINⅠ组的L1壳蛋白阳性率高于其他CIN组(P<0.01),≥CINⅢ组的P16蛋白阳性率高于其他3组(P<0.01);随访病例中HPV L1壳蛋白(+)/P16蛋白(-)的转阴率高,尤其在CINⅠ患者中该组高于其他几组(P<0.05)。结论 HPV L1壳蛋白与P16蛋白联合检测可成为诊断及预测宫颈病变的一个有效指标。

HPV16主要衣壳蛋白L1在昆虫细胞中的表达及免疫学活性分析

目的 在昆虫细胞中表达HPV16L1(m2 0 2 )蛋白 ,并分析其免疫学活性。方法 构建表达载体pFASTBACHTb L1(m2 0 2 ) ,用重组病毒感染sf9细胞表达HPV16L1(m2 0 2 )蛋白 ,SDS PAGE、western blot鉴定其表达 ,亲和层析和离子交换层析纯化后的产物经鼻腔免疫Balb/c小鼠 ,竞争抑制ELISA分析免疫血清的中和活性。结果 SDS PAGE、western blot结果证明HPV16L1(m2 0 2 )蛋白的表达 ,纯化复性后产率约为 17% ,免疫血清具有竞争抑制HPV中和单抗与HPV16L1(m2 0 2 )相结合的能力。结论 昆虫细胞表达的HPV16L1(m2 0 2 )