重组Lac-Z、反义c-myc腺病毒载体的增殖及鉴定

目的:建立重组反义c-myc腺病毒载体(Ad-AS-c-myc)、LacZ腺病毒(AD-Lac-Z)的增殖的方法。方法:对培养的293细胞转染重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体,使重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体在293细胞内大量复制,及时收集病变细胞,反复冻融以释放293细胞中的病毒载体,过滤除细胞碎片,利用倍比稀释法测定病毒载体滴度。PCR技术对扩增重组反义c-myc、Lac-Z腺病毒载体进行鉴定。结果:利用293细胞扩增重组腺病毒载体,获得的Ad-AS-c-myc滴度为:2.3×109pfu/ml;Ad-LacZ滴度为:1.2×1010pfu/ml。在Ad-LacZ可见在800bp出现一特异性PCR扩增条带,为腺病毒特异扩增带。Ad-AS-c-myc在800及608bp处出现两条特异扩增条带,分别为腺病毒及反义c-myc特异扩增条带。结论:对转染的293细胞冻融后收集重组腺病毒载体具有高效、可靠、简便、相对经济实用的优点,有推广价值。

顺铂联合重组人5型腺病毒腹腔灌注治疗胃癌合并恶性腹腔积液的临床疗效

目的探讨顺铂联合重组人5型腺病毒(H101)腹腔灌注治疗胃癌合并恶性腹腔积液的临床疗效。方法采用随机数字表法将68例胃癌合并恶性腹腔积液患者分为顺铂组(n=34,顺铂腹腔灌注)和顺铂联合H101组(n=34,顺铂联合H101腹腔灌注)。比较两组患者的腹腔积液缓解情况、腹腔积液间隔时间、生存情况、生活质量及不良反应发生情况。结果顺铂联合H101组患者腹腔积液总缓解率为73.5%,高于顺铂组患者的50.0%,差异有统计学意义(P﹤0.05)。顺铂联合H101组患者腹腔积液间隔时间为(34.02±9.79)天,明显长于顺铂组患者的(27.56±9.36)天,差异有统计学意义(P﹤0.01)。顺铂联合H101组患者的中位总生存期长于顺铂组(P﹤0.05)。两组患者的不良反应总发生率比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论顺铂联合H101腹腔灌注治疗胃癌合并恶性腹腔积液患者,能够安全有效地控制腹腔积液生成,改善患者的生活质量,延长患者的生存期。

表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒的构建与鉴定

为了构建出表达新布尼亚病毒(SFTSV)Gn基因的重组5型腺病毒,试验根据GenBank上发表的SFTSV Gn基因序列(登录号为ADZ04482.1)设计合成引物,采用特异性PCR方法在Gn基因前添加了KOZAK序列和tPA信号肽序列;然后通过酶切、连接等方法构建重组穿梭质粒PGA-KOZAK-tPA-Gn,与腺病毒骨架质粒pAd5-ΔE1ΔE3-5E4在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,得到重组腺病毒质粒rAd5-KOZAK-tPA-Gn,用PacⅠ酶酶切重组腺病毒质粒,并将线性化的质粒转染至HEK 293细胞中进行病毒包装、扩繁和纯化;采用PCR扩增、Western-blot等技术检测病毒基因的表达情况,并测定重组腺病毒效价。结果表明:通过PCR扩增获得了1 546 bp的KOZAK-tPA-Gn基因,并成功构建了重组穿梭质粒;SFTSV Gn基因在重组腺病毒传代过程中稳定存在;重组腺病毒在HEK 293细胞中表达出分子量约为61 ku的SFTSV Gn蛋白;测得重组腺病毒效价为1×10^(-7.63)/0.1 mL TCID_(50)。说明试验成功构建出表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒。

表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6重组腺病毒过表达载体的构建与鉴定

目的构建及鉴定携带小鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6(NLRP6)基因(NM_133946.2)的过表达重组腺病毒载体。方法合成小鼠NLRP6基因的编码序列,经酶切后插入腺病毒载体(GL2003),转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α进行培养,挑取转化子,进行聚合酶链反应(PCR)鉴定后送测序进行比对。采用蛋白质印迹法(Western blot)验证重组质粒中NLRP6蛋白的表达。利用Admax包装系统获得重组腺病毒载体Ad-NLRP6,导入HEK293细胞,经扩增纯化后测定病毒滴度。结果双酶切及DNA测序证明NLRP6成功构建入表达质粒中,同时检测其携带的FLAG标签蛋白,表明NLRP6表达水平显著升高。包装并生产携带NLRP6的重组腺病毒,进一步将病毒感染HEK293细胞,Ad-NLRP6细胞表达绿色荧光蛋白提示感染成功,收集病毒,经扩增纯化后测定病毒滴度为4×10^(10)PFU/mL。结论成功构建携带小鼠NLRP6基因的过表达重组腺病毒载体,这一结果为进一步研究NLRP6分子学功能提供了有效工具。

表达H7N9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒构建及其免疫效果评估

为构建H7N9亚型禽流感病毒和血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的二联疫苗候选株,试验通过CRISPR/Cas9和Cre-Loxp系统,以课题组前期构建的表达EGFP蛋白的重组病毒FAdV4-EGFP为载体,构建能够稳定表达H7N9亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白的重组血清4型腺病毒;并通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)、Westernblot试验以及SPF鸡保护性试验等方法,探究此重组病毒体外生物学特性并评估其为鸡提供的保护力。结果显示:研究成功构建能稳定表达H7N9禽流感亚型病毒HA蛋白的重组血清4型腺病毒,命名为FAdV4-H7;FAdV4-H7能在LMH细胞高效复制,并能在LMH细胞传代15次后仍能稳定表达HA蛋白;FAdV4-H7不仅高度致弱,而且能诱导机体产生高滴度针对H7N9亚型禽流感病毒HI抗体和FAdV-4的中和抗体,能为SPF鸡提供足够保护来抵抗致死性FAdV-4感染。研究表明,试验成功构建了重组病毒FAdV4-H7,为H7N9亚型禽流感病毒和FAdV-4的联防联控提供了二联苗候选疫苗株。

表达鸭坦布苏病毒衣壳蛋白的重组腺病毒载体构建与鉴定

为构建鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)衣壳蛋白的复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体的重组腺病毒,研究通过一步克隆技术将DTMUV Capsid基因插入到含有结核分枝杆菌的热休克蛋白70(mHsp70)为佐剂的pShuttle-CMV-Hsp70质粒中,构建能够表达DTMUV Capsid和mHsp70蛋白的重组穿梭质粒pShuttle-DTMUV Capsid,并与含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd-DTMUV Capsid。载体质粒经Pac I酶切线性化后转染至HEK 293A细胞,包装重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid。结果显示,rAdv-DTMUV Capsid在病毒传代过程中目的基因稳定存在,且病毒滴度可达2.3×10^(8)PFU/mL。Western blot等结果表明rAdv-DTMUV Capsid在HEK 293A细胞中表达了DTMUV特异性蛋白Capsid。DEF细胞感染试验证明rAdv-DTMUV Capsid可感染鸭源细胞,且诱导IFN-α、IL-10和IL-17 mRNA表达。结果表明,研究成功制备表达DTMUV Capsid蛋白的重组腺病毒rAdv-DTMUV Capsid,能引起细胞免疫反应,可作为一种候选疫苗。

ASFV抗原重组腺病毒的构建及免疫保护效果

为了构建非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗原重组腺病毒并探讨不同抗原的免疫原性,试验以ASFV基因Ⅱ型SY18株基因组为模板,采用无缝连接技术构建13种带有His标签的ASFV抗原重组腺病毒,通过间接免疫荧光技术鉴定重组腺病毒在HEK-239AD细胞中的表达情况,并用构建的13种重组腺病毒与前期构建的25种重组腺病毒分别于试验第0,14,28天免疫小鼠,200μL/只(重组腺病毒稀释至1×10^(8)TCID_(50)/mL)。第3次免疫后第7天,通过摘眼球方法采集血液,制备血清,利用血清中和试验筛选出5种效果较好的可刺激动物机体产生ASFV抑制性抗体的抗原,并将这5种重组腺病毒混合后免疫猪只,每种重组腺病毒(稀释至1×10^(8)TCID_(50)/mL)用量为0.5 mL/头;首免(第0天)后第14天进行二免,二免后第14天口服ASFV基因Ⅱ型SY18株(效价为1×10^(4)TCID_(50)/mL)200μL攻毒,探究重组腺病毒免疫保护效果。结果表明:本次试验构建的13种重组腺病毒均能在HEK-239AD细胞中稳定表达;从免疫小鼠血清中和试验筛选出5种抑制ASFV效果较好的重组腺病毒为rAdCMV-D129L、rAdCMV-EP84R、rAdCMV-E146L、rAdCMV-NP419L、rAdCMV-S273R。5头免疫重组腺病毒的猪均在攻毒后延迟发病,其中4头猪最终死亡,1头存活,保护率为20%,免疫PBS的猪只在攻毒后发病快,并全部死亡。说明ASFV抗原重组腺病毒可以刺激机体产生免疫反应,但用经过血清中和试验筛选出来的5种抗原制备的重组腺病毒无法提供完全保护。

猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗对仔猪免疫效果的研究

为了评价猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗(Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗)对仔猪的免疫效果,试验将12头仔猪随机分为3组,分别为Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组、重组空载体腺病毒组和PBS对照组,分别于3组仔猪的颈部肌肉注射Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗(浓度为1×10^(10)pfu/mL)、空载体重组腺病毒(浓度为1×10^(10)pfu/mL)和PBS各2.5 mL,于试验第0,21天分两次免疫。第2次免疫后第14天,麻醉后手术切除仔猪脾脏,采用密度梯度离心法提取猪脾脏淋巴细胞,利用流式细胞仪检测仔猪CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量。于第1次免疫前(第0天)及免疫后第7,14,21,28,35,42,49天无菌采集各组试验猪的颈静脉血,分离血清,检测每组仔猪抗猪附红细胞体特异性抗体IgG效价及IgG_(1)、IgG_(2a)和细胞因子白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)水平,评价Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗对仔猪的细胞与体液免疫应答效果。结果表明:Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量极显著高于重组空载体腺病毒组和PBS对照组(P<0.01),Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的CD4^(+)/CD8^(+)显著高于重组空载体腺病毒组和PBS对照组(P<0.05),重组空载体腺病毒组和PBS对照组之间的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞含量及CD4^(+)/CD8^(+)差异不显著(P>0.05)。免疫后第28,35,42,49天,Ad5-M/eno重组腺病毒疫苗组的抗猪附红细胞体特异性IgG抗体效价及IgG_(1)、IgG_(2a)和细胞因子IL-4和IFN-γ水平极显著高于重组空载体腺病毒组与PBS对照组(P<0.01),重组空载体腺病毒组与PBS对照组之间差异不显著(P>0.05)。说明猪附红细胞体eno基因重组腺病毒疫苗可以诱导仔猪产生强烈的细胞免疫和体液免疫应答。

小鼠Slfn3重组腺病毒载体的构建及其在EPCs中转染效率的测定

目的构建携带小鼠Schlafen3(Slfn3)基因的重组过表达质粒,并观察其在内皮祖细胞(EPCs)中的转染效率。方法从GenBank基因数据库获取小鼠Slfn3基因序列,利用VectorNTI软件对其进行引物设计,通过PCR扩增获得目的基因,将所得到的目的基因与穿梭载体pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-MCS-3xFLAG相连接,获得重组腺病毒载体pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG;筛选阳性克隆抽提质粒,通过限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切鉴定,并通过DNA测序验证;采用Admax系统将目的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒一同转染HEK293细胞获得重组腺病毒(Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG),对其进行病毒滴度测定,Western blot验证Slfn3蛋白的表达;体外培养小鼠脾源EPCs 5~7 d,细胞密度达70%后,用Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG进行转染48 h后,采用荧光显微镜观察并统计绿色荧光细胞数量,计算Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG转染的效率。结果DNA测序验证Ad-pcADV-EF1-mNeonGreen-CMV-Slfn3-3xFLAG构建成功,病毒滴度为3.16×1010(ifu/mL);腺病毒包装之后的重组腺病毒能够转染HEK293细胞,并在细胞中表达Slfn3-EGFP-3xFLAG融合蛋白,且含有Flag标签的蛋白,大小为57 kDa;重组腺病毒在EPCs中的转染效率为(71.43±2.58)%。结论成功地构建了小鼠Slfn3的过表达重组腺病毒载体,且在EPCs转染效率较高。

多聚阳离子对重组腺病毒载体体外转染血液肿瘤细胞效率的影响

目的:检测多聚阳离子复合物(Polycation)对腺病毒载体转染血液肿瘤细胞效率的影响。方法:重组LacZ腺病毒(Ad-LacZ)联合Polycation分别转染HL-60、K562、Jurkat及Raji细胞,观察阳性细胞百分率。结果:Ad-LacZ单独转染肿瘤细胞时转染率较低。联合Polycation共同转染可明显提高腺病毒载体的转染率。结论:多聚阳离子复合物可做为提高Ad-LacZ转染HL-60、K562、Jurkat及Raji细胞的辅助工具。

用重组腺病毒表达A组轮状病毒主要中和抗原VP7可获得良好的免疫学效果

为探索利用重组腺病毒表达轮状病毒的结构抗原以制备轮状病毒基因工程疫苗的可行性 ,构建了一株可表达A组轮状病毒主要中和抗原VP7的重组腺病毒AdEasyCVP7。AdEasyCVP7感染 2 93细胞后 ,RT PCR证明VP7基因有转录 ,Westernblotting试验可检测到VP7的表达。随后 ,用AdEasyCVP7通过灌胃和滴鼻两种不同途径免疫小鼠 ,并对免疫后小鼠的血清抗体和粘膜抗体进行了比较。初次免疫后 ,两组小鼠均有应答 ,但血清抗体滴度及阳转率不同。再次免疫后 ,滴鼻组小鼠显示出明显的加强效果。对肺灌洗液中的sIgA及肺、肠粘膜组织匀浆中的IgA进行检测 ,发现滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对血清中和抗体的检测表明 ,初次和再次免疫后 ,两组小鼠血清中均有中和抗体产生。该研究为轮状病毒基因工程疫苗的免疫方案、免疫途径及免疫保护作用等的进一步研究奠定了基础。

串联表达PRRSV M与GP5蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究

利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因,按正确的读码框与GP5基因串联,成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-M-GP5,经PCR、测序鉴定正确。PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,产生重组腺病毒DNA。重组腺病毒DNA经PacⅠ线性化后用脂质体转染HEK-293A细胞,在细胞内包装成完整的腺病毒,通过IFA可以检测到M与GP5串联的重组腺病毒构建成功,可以正确地表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,结果表明可以诱导产生较强的体液免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和CTL反应)。证明该重组腺病毒具有较好的免疫原性,为下一步猪体免疫试验奠定了基础。

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒的构建及其在兔体内的免疫原性分析

为了构建猪瘟重组腺病毒载体疫苗,通过细菌内同源重组法构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2。测定其一步生长曲线,同时用间接免疫荧光试验和Western blotting检测外源基因表达,然后用rAdV-E2免疫家兔,免疫后6周用猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)进行攻击,攻毒后3 d取其脾脏,用实时荧光定量RT-PCR检测C株病毒RNA。结果表明,该重组腺病毒传至第10代时,毒价可达1.0×1010 TCID50/mL;外源基因可在其中得到稳定表达;rAdV-E2接种兔免疫后2周产生猪瘟特异性抗体,免疫后5 w抗体达到峰值,攻毒后rAdV-E2接种兔和C株接种兔均未出现定型热反应,从其脾脏也未检测到C株病毒RNA,而野生型腺病毒接种兔均出现了定型热反应,并且从其脾脏检测大量C株病毒RNA,其含量达到了103拷贝/μL以上。由此表明,rAdV-E2可望开发为猪瘟候选疫苗。

应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒

目的 :利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在 2 93细胞制备高滴度重组病毒。方法 :自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR3 1 -CCRK中酶切出CCRK基因 ,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV中 ,形成转移质粒pAdTrack -CMV -CCRK ,采用电穿孔或化学转化法在大肠杆菌BJ51 83内与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1同源重组 ,得到重组腺病毒载体pAd -CCRK。以pAd -CCRK为模板 ,经DNA测序正确后 ,用PacI酶切线性化pAd -CCRK ,转染 2 93细胞 ,包装成重组病毒颗粒 ,荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达 ,采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。将重组病毒上清感染RAW细胞 ,荧光显微镜下观察感染细胞重组病毒的表达。结果 :成功地构建了携带CCRK基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒 ,重组病毒能在体外高效表达。结论 :应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体 ,可高效制备均一的高滴度重组病毒 。

小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体,并观察其对NIH3T3细胞的感染情况。方法采用基因工程技术,经过2次亚克隆将Osf2/Cbfa1基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染293T细胞包装、扩增,将重组腺病毒对成纤维细胞株NIH3T3进行感染。采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明Osf2/Cbfa1基因重组腺病毒载体成功,病毒滴度达(1.6×1012)pfu/ml,并对NIH3T3细胞有很强感染能力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠Osf2/Cbfa1基因的重组腺病毒载体。

猪流行性腹泻病毒重组腺病毒疫苗的构建及小鼠免疫试验

通过RT-PCR和重组PCR技术扩增出猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)疫苗株sM、M、S基因,构建重组腺病毒穿梭质粒。穿梭质粒与BJ5183细菌同源重组构建同源重组腺病毒质粒,同源重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后转染AD-293细胞,获得3个含有目的基因的重组腺病毒。将3个具有感染能力的复制缺陷性重组腺病毒共同感染Vero细胞,细胞上清液进行小鼠免疫特性研究。结果表明,共同感染Vero细胞所得蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。

表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack CMV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E.coliBJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Westernblot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1∶10000和1∶1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100%。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的 了解CTLA 4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率 ,为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法 用所构建的CTLA 4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞、人成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞 ,应用免疫组化检测CTLA 4Ig的表达情况。结果 与重组腺病毒共培养 6h使HeLa细胞获得转染 ,12h开始表达 ,36h表达达高峰 ;人成纤维细胞 8h获得转染 ,2 4h开始表达 ,6 0h后达高峰 ;人脐静脉内皮细胞 4h获得转染 ,12h开始表达 ,36h后达高峰。结论 CTLA 4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞、人成纤维细胞。