重组NADPH-细胞色素P450还原酶在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 在大肠杆菌中表达重组NADPH -细胞色素P4 5 0还原酶 (CPR)并纯化获得有活性的CPR蛋白。方法 将已构建的NADPH -细胞色素P4 5 0还原酶重组质粒pMW1 72a CPR采用温和转化法转入大肠杆菌BL 2 1中 ,依次使用超速离心、DE5 2纤维素阴离子交换层析和 2′ 5′ADP亲和层析的方法纯化CPR ,并检测酶的活性。结果 获得了纯度达 99%以上的可溶性CPR蛋白 ,纯化倍数 5 .2 0倍 ,检测酶的比活性为每分钟 1 0 4 5 .4 9nmol mg。结论 获得了纯度高、有活性的CPR蛋白 ,可作为工具酶用于某些相关酶的研究 。

家蚕氟中毒后中肠NADPH-细胞色素P450还原酶和NADPH-细胞色素C还原酶活性的变化

为了探究家蚕对NaF的代谢机制,以家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种734为材料,从5龄起蚕开始分别添食50、100、200、400 mg/kg NaF溶液处理后的桑叶,检测蚕体中肠微粒体酶液中的黄素蛋白NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)和NADPH-细胞色素C还原酶(CR)的活性变化。氟物化敏感品种734的4个NaF处理组第3天的中肠CPR活性低于对照组,其余时间几乎都高于对照组,400 mg/kg NaF处理组在第4天的CPR活性最高,且各NaF处理组的CPR活性差异显著(P<0.05);耐氟品种T6 NaF处理组和对照组的中肠CPR活性整体上呈先升后降的趋势,几乎都在第2天达到最高值,各组之间的差异不显著(P>0.05)。氟化物敏感品种734的4个NaF处理组的中肠CR活性呈现先升后降的趋势,而对照组呈下降趋势;耐氟品种T6的50、100、400 mg/kg NaF处理组在第1～2天的中肠CR活性呈明显下降趋势,之后的变化相对较小,对照组的CR活性仅在第3～4天略高于NaF处理组,而其余时间NaF处理组的CR活性较高。2个家蚕品种添食不同浓度NaF后的中肠CR活性差异均不显著(P>0.05)。试验结果显示,耐氟品种T6在NaF作用下中肠的CPR和CR活性变化范围(分别为对照组的0.4～2.0倍和0.3～2.9倍)远小于氟化物敏感品种734这2种酶的活性变化范围(分别为对照组的0.6～9.3倍和0.4～4.6倍)。初步推测CPR和CR与家蚕对氟化物代谢具有一定的关联。

人源细胞色素C在大肠杆菌中的重组表达和分离纯化

细胞色素C在电子传递、缺氧应激和细胞凋亡的过程中起重要作用。通过人源细胞色素C和酵母细胞色素C亚铁血红素裂解酶共表达,从大肠杆菌中获得了可溶性的重组人源细胞色素C蛋白。细菌经过超声破碎后,获得的上清经350g/L硫酸铵沉淀去除杂蛋白,再经过两次SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析,获得了纯度大约为80%的人源细胞色素C。每升菌可产出10mg以上重组细胞色素C。人源细胞色素C的重组表达和纯化有助于细胞色素C功能的深入研究和应用。

NADPH-细胞色素C还原酶参与Graves病甲状腺过氧化氢生物合成

目的 :探讨NADPH -细胞色素C还原酶 (CR)在Graves病甲状腺过氧化氢 (H2 O2 )生物合成中作用。方法 :应用高香草酸荧光分析等技术测定Graves病和正常甲状腺H2 O2 浓度和CR活性 ,观察CR活性变化对H2 O2 合成的影响。结果 :Graves病甲状腺CR活性和H2 O2 水平均明显高于正常而H2 O2 酶活性无改变。加CR抑制剂对氯汞苯甲酸后 ,Graves病和正常甲状腺CR活性降低 84% ,同时H2 O2 水平下降近 5 7%。H2 O2 水平随CR活性降低而降低 ,两者呈显著正相关。结论 :CR参与Graves病甲状腺内H2 O2 生物合成 ,是甲状腺内H2 O2 生成的重要途径。

重组色素上皮细胞衍生因子抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管及兔角膜新生血管

目的:观察制备的重组色素上皮细胞衍生因子(rPEDF)对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管及兔角膜新生血管的抑制作用。方法:制备rPEDF,采用鸡胚绒毛尿囊膜分析,观察rPEDF抑制新生血管生长情况。利用碱烧伤制作兔角膜新生血管模型,观察rPEDF抑制角膜新生血管生长状况。结果:rPEDF能明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长。rPEDF治疗组兔角膜新生血管长度及生长面积明显少于对照组(P<0.05),差异有统计学意义。结论:制备的rPEDF抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长,抑制兔角膜新生血管的形成。

六种大鼠肝微粒体细胞色素P450重组酶系对33种外来化合物的代谢

多氯联苯诱导的六种鼠肝微粒体细胞色素P450重组酶系A_1,A_2,B,C_1,C_2和D对33种外来化合物代谢的催化速率不同,其中以C_1酶系和C_2酶系催化活力最强,其次为A_1酶系,B酶系催化活力最弱,外来化合物的种类不同,经重组酶系催化的途径也不同,如卤代烷烃,卤代烯烃,苯及其同系物,亚硝胺类等化合物主要经P450C_1酶系代谢,而大多数有机磷酸酯,氨基甲酸酯类化合物及多环芳烃类致癌物则以P450 C_2酶系代谢为主。

重组CCL2小鼠黑色素瘤B-16细胞的建立及生物学活性的鉴定

目的:在小鼠黑色素瘤B-16细胞中克隆表达趋化因子CCL2,以进一步研究趋化因子与肿瘤的关系。方法:从小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增CCL2 cDNA,将此片段重组于真核表达载体pcDNA3.0,脂质体FuGENE6转染鼠黑色素瘤B-16细胞,G-418筛选阳性克隆。结果:RT-PCR和免疫细胞化学鉴定转染B-16细胞中有较强CCL2的表达,体外趋化实验表明重组CCL2有生物学活性。结论:获得有趋化活性的重组CCL2的小鼠黑色素瘤B-16细胞。

重组腺相关病毒介导的细胞色素P450表氧化酶基因对TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞炎症的影响

目的研究过度表达细胞色素P450表氧化酶基因引起内源性EETs产生增加是否能抑制由TNF—α诱导的内皮炎症。方法以携带三种不同表氧化酶基因的重组腺相关病毒rAAV- CYP2C11、rAAV—CYP2J2和rAAV—CYPF87V转染人脐静脉内皮细胞,然后再以TNF—α干预,来研究它们对内皮VCAM-1的表达及外周血单核细胞PBMC与内皮细胞粘附的影响。结果TNF-α诱导了 HUVEC中VCAM-1蛋白质的表达,rAAV—CYP2C11、rAAV—CYP2J2能明显抑制TNF-α的这一作用。 TNF-α诱导了PBMC与HUVEC的粘附(100±0．0％ vs 620．1±65．3％),rAAV-CYP2C11、rAAV- CYP2J2能明显抑制TNF-α的这一作用(分别为120．3±33．4％ vs 387．7±27．4％．131．0±28．7％ vs 535．0±69．7％)。结论CYP2C11和CYP2J2基因具有显著的保护内皮细胞、对抗炎症介质介导的内皮损伤的作用。

重组家蝇细胞色素P450 6A1的大肠杆菌对艾氏剂的生物降解作用

以大肠杆菌为宿主表达家蝇细胞色素P450 6A1(CYP6A1)酶,在CYP6A1基因后面加入人细胞色素P450还原酶CPR基因,验证了CPR酶对CYP6A1酶催化功能的影响,和CYP6A1酶、重组大肠杆菌对艾氏剂的代谢能力.结果表明:CYP6A1蛋白对艾氏剂有环氧化作用,在CYP6A1对艾氏剂催化中起关键作用.将5μmol/L艾氏剂加入重组大肠杆菌菌液8 h可检测到163.36nmol/L艾氏剂环氧化产物狄氏剂,说明CYP6A1-CPR宿主菌对艾氏剂具有代谢能力,可用于艾氏剂污染的土壤的生物降解.

重组人酸性成纤维细胞生长因子联合超脉冲二氧化碳激光治疗色素痣的临床疗效观察

目的观察重组人酸性成纤维细胞生长因子(rh-aFGF)在超脉冲二氧化碳激光治疗色素痣术后对创面愈合的影响。方法选取2018年3月~2019年3月我院因色素痣就诊的患者200例,随机分成观察组和对照组,每组100例。观察组予超脉冲二氧化碳激光联合重组人酸性成纤维细胞生长因子(rh-aFGF),对照组予超脉冲二氧化碳激光联合生理盐水。两组均外用盐酸金霉素眼膏预防创面感染7d。观察比较两组术后疗效及不良反应情况。结果两组治疗后即刻无差异,湿敷后、术后1周、术后3月观察组治疗局部创面恢复情况均明显优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。术后3月观察组创面修复显著72例,占72%,总有效率为85%;对照组修复显著20例,占20%,总有效率为55%。观察组总有效率明显高于对照组(P<0.05)。观察组出现3例瘢痕增生,分别位于上唇1例,颈部2例;对照组出现2例瘢痕增生,均位于上唇。两组患者瘢痕增生比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论二氧化碳激光治疗色素痣术后应用重组人酸性成纤维细胞生长因子(rh-aFGF)对促进创面愈合疗效明显,可有效降低激光术后色素沉着及凹陷性瘢痕形成几率。

重组拟南芥细胞色素P450 707A3在大肠杆菌中的原核表达

拟南芥细胞色素P450 707a基因是编辑脱落酸8-羟化酶的基因,克隆其中的cyp707a3基因并构建表达载体p CWori(+)-cyp707a3,在E.coli Rosseta菌株中原核表达并得到了具有活性的酶蛋白.结果显示:大部分酶蛋白定位于大肠杆菌细胞膜.

NADPH-细胞色素C还原酶对碘有机化的影响

目的 :探讨NADPH 细胞色素C还原酶 (CR)在碘有机化中的作用。方法 :应用荧光分析和同位素技术测定甲状腺H2 O2 浓度、CR活性和蛋白结合碘 (PBI) ,观察CR所引起的H2 O2 变化对PBI形成的影响。结果 :Graves病甲状腺CR活性高于正常 ,其H2 O2 水平和所形成的PBI亦明显高于正常 ;加CR抑制剂后 ,Graves病和正常甲状腺CR活性降低近 84 % ,同时H2 O2 下降近4 5% ,PBI形成随CR和H2 O2 水平降低而减少 ;而葡萄糖 /葡萄糖氧化酶系统可使PBI恢复正常。结论 :CR通过其所产生的H2 O2影响PBI的形成 。

重组细胞色素P4503A4和P4503A22细胞微粒体药物代谢动力学比较研究

目的:利用已建立的巴马小型猪细胞色素P4503A22和P4503A4稳定表达重组肝癌细胞株微粒体,分析比较二者的药物代谢动力学特征.方法:以P4503A特异性代谢底物硝苯地平(NF)、睾酮及其抑制剂酮康唑(KCZ)为探针药物,将探针药物与重组P4503A4,P4503A22细胞微粒体在优化的微粒体浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育,通过高效液相色谱仪检测其药物代谢(抑制)动力学参数,并将二者进行比较分析.结果:P4503A22的硝苯地平、睾酮的代谢活性均低于P4503A4(p<0.05);酮康唑对P4503A4和P4503A22的硝苯地平代谢具有较强的抑制活性,但酮康唑对P4503A4的抑制活性强于P4503A22(p<0.05).结论:无论是代谢底物或抑制底物活性,重组P4503A22细胞微粒体活性均低于重组P4503A4细胞微粒体活性.

携细胞色素P4501A1cDNA的高表达型重组载体构建及转基因细胞系的

携细胞色素Ｐ４５０１Ａ１ｃＤＮＡ的高表达型重组载体构建及转基因细胞系的建立董海涛，吴健敏，余应年，朱丽君（浙江医科大学病理生理学教研室及医学分子生物学实验室杭州３１００３１）构建具高效、稳定、持续表达细胞色素Ｐ４５０基因产物的细胞系对建立更符合体内状...

3-氨基苯二酰肼发光法在微粒体和重组细胞色素P450酶系中的毒理学应用(英文)

本文分别从微粒体和重组细胞色素P450酶系水平,研究了3-氨基苯二酰肼(luminol)化学发光在毒理学中的应用。研究结果表明luminol化学发光法不仅可用于P450酶系活力的测定,也可用来检测反应体系中由外来化合物代谢转化而产生的自由基。自由基清除剂SOD、过氧化氢酶和二甲亚砜对多种重组酶系的化学发光均有不同程度的淬灭作用,其中以SOD作用最强,其抑制率为93～100％。44种外来化合物的重组酶系化学发光的测定结果表明,已知在代谢转化过程中形成自由基的化合物,其化学发光强度明显增强,如四氯化碳、三氯甲烷、四氯乙烯等;经代谢转化后毒作用增强的化合物,其发光强度有的增强,如二硫化碳、苯、甲苯、甲基对硫磷等,有的不变或减弱,如对硫磷、苯胺、马拉硫磷等;毒作用与代谢转化关系不很密切的化合物,其发光强度与对照比较无变化或减弱,如氨基比林等,多环芳烃类和亚硝胺类致癌物的发光强度,除3-甲基胆蒽、二甲基亚硝胺外,均无明显变化。

重组缣孢菌细胞色素P-450nor的性质研究

纯化的重组缣孢菌细胞色素P 4 50nor(recombinantfusariumoxysporumcytochromeP 4 50nor ,rF·P 4 50nor)用于动力学研究 .测得米氏常数Km (NO)和Km (NADH)分别为 0 1 2 8mmol/L和0 2 0 8mmol/L .Vmax (N2 O)为 1 1 363min- 1.光谱吸收特性研究表明 :rF·P 4 50nor具有典型的血红素蛋白的特性 ,在 4 1 3nm有最大吸收峰 .加入还原剂Na2 S2 O4 时 ,最大吸收峰前移至 4 0 5nm .与CO结合后 ,再加入还原剂Na2 S2 O4 时 ,在 4 50nm处表现最大吸收 .与NO结合后 ,最大吸收峰移至4 30nm附近 .这些光谱特征的变化与天然的F·P 4

重组细胞色素P4503A4与P4503A39微粒体药物代谢活性比较研究

目的:通过考察已建立的P4503A39和P4503A4稳定表达重组细胞株微粒体药物代谢动力学特征,旨在分子水平为巴马小型猪作为临床药物代谢试验动物提供科学依据。方法:制备重组细胞微粒体,以P4503A特异性代谢底物硝苯地平(NF)、睾酮及其抑制剂酮康唑(KCZ)为探针药物,将其与重组P4503A4、P4503A39细胞微粒体在优化的微粒体浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育,获得药物代谢(抑制)动力学参数,并将二者进行比较分析。结果:P4503A39和P4503A4体外微粒体药物代谢动力学参数Vmax、Km(S50)、Clint及IC50均表明:P4503A39的硝苯地平、睾酮的代谢活性及酮康唑的抑制活性均显著低于P4503A4(P<0.05)。结论:重组P4503A39细胞微粒体活性显著低于重组P4503A4细胞微粒体活性。

鸡细胞色素P450 1A5的原核表达与活性重组

旨在对鸡细胞色素P450 1A5(CYP1A5)蛋白进行体外功能研究,采用大肠杆菌系统进行CYP1A5的异源表达。以鸡的cDNA为模板,扩增出CYP1A5基因,将该基因的N端编码区进行修饰,并连接到pCW载体中构建His-CYP1A5,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达。经CO-差示光谱检测,所获得的His-CYP1A5具有典型的P450吸收峰。该蛋白与细胞色素P450还原酶(CPR)进行体外重组,构成的重组酶系表现出乙氧基试卤灵-O-脱乙基酶活性。结果表明,所采用的表达策略可以成功产生出具有催化活性的鸡细胞色素P450 1A5(CYP1A5)蛋白。

人细胞色素P450 2C9 cDNA的克隆、鉴定及真核细胞表达重组质粒的构建

从人肝组织中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增人细胞色素Ｐ４５０２Ｃ９的ｃＤＮＡ。以Ｔ－Ａ克隆方法将该基因的ｃＤＮＡ连接到ｐＧＥＭ－３Ｚ质粒上，然后通过内切酶图谱分析及部分序列分析加以鉴定，结果显示克隆片段具有人细胞色素Ｐ４５０２Ｃ９内切酶图谱和核苷酸序列，该片断含５′端和３′端部分非编码区及完整的编码区。最后将该ｃＤＮＡ片段连接到哺乳动物细胞的表达质粒ｐＲＥＰ９中。为建立表达人细胞色素Ｐ４５０２Ｃ９基因的细胞系打下了基础。

重组人酸性成纤维细胞生长因子联合Elos激光治疗烧伤后色素沉着疗效观察

目的:探讨重组人酸性成纤维细胞生长因子(rh-aFGF)联合Elos激光治疗烧伤后色素沉着的临床疗效。方法:选取2015年1月-2016年7月因烧伤后色素沉着的患者共80例,随机分为观察组和对照组,每组40例,观察组采用重组人酸性成纤维细胞生长因子联合Elos激光治疗;对照组仅用Elos激光治疗,比较两组患者在治疗前、治疗后1个月、2个月、3个月后的色素程度、色素沉着面积的变化。结果:两组患者治疗前的平均色素沉着面积和色素程度评分比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后1、2、3个月两组患者的色素沉着面积和色素程度评分均显著下降(P<0.05)。其中治疗1、2、3个月个后,观察组的色素沉着面积均显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);观察组在治疗1、2、3个月个后的色素程度评分均显著低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。观察组的总有效率为100%,对照组的总有效率为80%,观察组患者的总有效率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:rh-aFGF联合Elos激光治疗烧伤后色素沉着具有显著的促进色素沉着消退的作用,安全有效,值得临床应用推广。