重组NP蛋白抗原检测SIV抗体间接ELISA方法的建立

用纯化的H9N2亚型猪流感可溶重组NP蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流感抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为12.5μg/mL,37℃1 h,4℃过夜;血清稀释度为1∶40;酶标SPA稀释度为1∶10 000,37℃温育40 min,底物显色37℃15 min。经重复性试验、交叉试验、竞争抑制试验等试验,结果表明该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用TG-ROC软件确定了自制ELISA(NP-ELISA)酶标板的临界值为0.20,特异性和敏感性分别为95.83%和91.43%。与美国IDEXX试剂盒相比较,符合率为94.00%,无显著性差异。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本356份,总阳性率为35.40%。

重组汉坦病毒核壳蛋白的制备及其单克隆抗体的研制

将ＰＣＲ扩增的ＨＴＶ７６－１１８ＲＮＡ小片段的ｃＤＮＡ克隆插入到载体ｐＤＳ５６／ＲＢＳⅡ－（Ｏ）－６Ｈｉｓ中，通过ＩＰＴＧ诱导表达以及镍螯合层析纯化重组ＮＰ，经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫转印和ＥＬＩＳＡ方法分析其蛋白特性，证实该重组ＮＰ与毒粒ＮＰ相同，均为４９．６ｋｕ，能与肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者血清产生特异性反应。以此重组ＮＰ作为抗原制备抗ＮＰ单克隆抗体，获得两株持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用抗ＮＰＭｃＡｂ建立检测ＩｇＭ抗体的ＥＬＩＳＡ捕获法。证实纯化重组ＮＰ作为抗原，避免了组织培养病毒的感染性和非特异性以及难以标准化的缺点。所建立的ＥＬＩＳＡ捕获法检测ＨＦＲＳ患者血清中ＩｇＭ抗体的方法特异性强、敏感性高。

甲型流感病毒NP含量ELISA检测方法的建立

目的：建立一种双抗体夹心ELISA检测方法,以检测流感疫苗中甲型流感病毒的核蛋白（NP）含量。方法：体外重组表达NP作为ELISA法测定蛋白含量参考品,筛选捕获抗体和检测抗体工作浓度、起始浓度和系列稀释倍数,建立ELISA法并对其进行优化和验证。结果：获得的重组NP纯度为99.0%以上。建立和优化后的ELISA参数：捕获抗体4μg·m L^-1,检测抗体1∶1 000。NP含量参考品起始浓度为300~600 ng·m L^-1,四参数拟合S型曲线的决定系数R^2大于0.95,对疫苗中的甲型流感病毒NP具有特异性,原液和成品的加标回收率为88.2%~95.3%,方法重复性（n=5）的RSD小于15%。结论：建立的流感疫苗中甲型流感病毒NP含量ELISA检测方法特异性好,准确性和精密性高,可用于疫苗样品中甲型流感病毒NP含量的检测。