猪流行性腹泻病毒nsp1、nsp5和N蛋白的重组腺病毒载体的构建及免疫原性比较

为研究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)nsp1、nsp5和N蛋白的免疫原性,试验以复制缺陷型人腺病毒5型(AdMax系统)为载体,利用PEDV-GDgh毒株(登录号为MG983755),通过PCR方法扩增出GDgh毒株nsp1、nsp5、N基因,并将其连接到腺病毒穿梭载体上,构建重组穿梭质粒。将3个重组穿梭质粒和腺病毒骨架载体共转染至HEK-293A细胞中获得第1代重组腺病毒,分别命名为rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N。用第1代3株重组腺病毒接种HEK-293A细胞,连续传代,通过RT-PCR和Western-blot方法鉴定第3代重组腺病毒,并采用Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量(TCID_(50))。以3株重组腺病毒的第3代病毒液免疫小鼠,收集血清并检测特异性IgG抗体水平。结果表明:试验成功构建出带有nsp1、nsp5、N基因的重组穿梭质粒;分别用重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N感染正常HEK-293A细胞,可产生典型的细胞病变并观察到荧光信号;目的基因正常转录后得到的目的蛋白可正确表达;3株重组腺病毒rAd-nsp1、rAd-nsp5、rAd-N的TCID_(50)依次为1×10^(-8.35)/mL、1×10^(-8.50)/mL、1×10^(-7.66)/mL;免疫小鼠后均可产生针对目的蛋白的特异性抗体。说明试验成功构建的3株正常表达目的蛋白的重组腺病毒均具有免疫原性。

表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5 HA-EGFP。采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5 HA-EGFP)。经目的基因PCR检测及序列测定,结果表明:HA基因已经正确地插入到腺病毒的基因组中;通过RT-PCR检测与Western blot分析,结果表明:HA基因能够进行正确转录,并且所表达的蛋白具有相应的生物学活性。子代重组腺病毒rAd-H5 HA-EGFP经增殖、纯化后感染性滴度可达2.26×1010TCID50mL-1。rAd-H5 HA-EGFP免疫BALB/c小鼠能够诱导特异性的HI抗体产生,有效阻止病毒在体内的复制。

自然发生的1株传染性支气管炎病毒S1和N基因之间的重组

本研究从出现典型呼吸道和肾脏病变的患病雏鸡中分离出1株传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitisvirus,IBV),命名为SC06,旨在探讨该病毒的重组机制。SC06接种10日龄SPF鸡胚可出现明显的"侏儒胚";对5日龄SPF鸡攻毒,可诱发呼吸道症状和肾脏病变。对其S1和N基因分别克隆测序,结合在GenBank中发表的其他IBV参考株序列,对其S1和N基因核苷酸(氨基酸)序列分别进行同源比较,绘制系统发育树。结果表明:SC06与英国4/91株的S1基因核苷酸(氨基酸)同源性最高,为98.7%(98%),而与国内大部分流行株的核苷酸同源性仅为75.6%～76.0%;然而,SC06与国内流行株DY06、SDGE01的N基因核苷酸(氨基酸)同源性达99.3%(99%)、93.4%(93.6%),而与英国的4/91的N基因核苷酸(氨基酸)同源性仅为85.7%(92.4%)。S1基因系统发育方面,SC06与英国的4/91和7/93B属于同一基因型,而与作者实验室近年分离的SDGE01等大部分山东流行株及国内流行的LX4等株分属不同的基因型;但其N基因分型时,SC06和DY06与国内部分流行株属于同一个进化分支,而与英国的4/91和7/93B不同。综合上述结果,推测SC06为英国4/91和国内流行株的重组株,其S1基因来自4/91疫苗,而N基因来自国内DY06类型的IBV国内流行株。

重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)免疫鸡抗体消长规律及免疫程序的初步研究

研究新型重组H5N1亚型禽流感灭活疫苗对种鸡和肉鸡的免疫原性,并对雏鸡母源抗体和免疫后的抗体进行动态观察,根据试验结果推荐该疫苗对鸡的免疫程序。用HI方法检测种鸡、肉鸡的母源抗体和免疫抗体,根据母源抗体的衰减和免疫抗体的消长规律确定首免和再免日龄。结果表明种鸡的母源抗体约能维持10 d多;0.3 mL/羽首免后10 d HI抗体就可达到6.40 log2,3-5周达到高峰期,至免疫17周后(19周龄)HI抗体水平仍然维持在4.88 log2;19周龄时0.5 mL/羽进行二免,有效抗体能维持约20周;280日龄0.5 mL/羽三免后抗体水平均一,下降缓慢,至种鸡淘汰时(三免后29周)抗体水平仍能维持在5.32 log2。肉鸡母源抗体约能维持7d,10日龄时0.3 mL/羽免疫,有效抗体能维持到上市。新型重组H5N1亚型禽流感灭活疫苗对鸡的免疫原性确实。

重组蓝藻抗病毒蛋白N的纯化复性及其抗单纯疱疹病毒1型活性的研究

目的纯化复性重组蓝藻抗病毒蛋白N(cyanovirin-N,CV-N)并研究其抗病毒活性。方法将诱导表达的重组CV-N经Ni Sepharose柱纯化并以稀释法复性,在Vero细胞中进行CV-N抗单纯疱疹病毒1型(herpes si mplex virus type1,HSV-1)活性的研究。通过观察细胞病变效应(CPE)及MTT比色法检测细胞活性,以判断CV-N的抗病毒效应。结果重组CV-N经Ni Sepharose柱纯化后,SDS-PAGE显示11KDa处清晰的单一条带,复性的重组CV-N对Vero细胞毒性极低,对HSV-1无直接灭活作用,CV-N对病毒的吸附及生物合成均有抑制作用,且强于阳性对照药物阿昔洛韦。结论经纯化复性的CV-N具有良好的抗HSV-1活性,值得进一步研究和开发。

对重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)在家禽免疫效果方面的调研

2006-2007年，通过检测免疫注射H5N1重组禽流感病毒灭活疫苗（Re-1株）后3～4周的444个鸡场、66个鸭场和28个鹅场共计16140份血清中H5亚型禽流感血凝抑制抗体水平，比较A、B、c、D、E5个不同厂家的疫苗对鸡、鸭、鹅免疫效果。结果显示：重组禽流感灭活疫苗（H5N1亚型，Re-1株）对鸡的免疫效果明显好于鸭和鹅；不同厂家疫苗质量和免疫效果有差异，其中A厂疫苗质量和免疫效果最好。

禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的重组牛痘病毒表达

目的研究H5 I151F和H5 I151F＋A134V＋E186D两种氨基酸变异对血凝素蛋白（HA）亲人受体结合的影响，并获得该HA。方法构建载体pRB21’，共感染／转染vp37^-牛痘病毒vRB12和pRB21’，基因同源重组牛痘病毒表达HA，Western免疫印迹法鉴定。结果获得了克隆有H5HA全长基因片段的载体pRB21’，构建了2种重组牛痘病毒re-VV H5 I151F和re-VV H5 I151F＋A134V＋E186D，且能在被感染细胞膜表达这两种HA。结论首次通过构建重组牛痘病毒成功表达了禽流感病毒H5N1的H5HA，为进一步研究禽流感病毒人传人的可能性奠定了基础。

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及鉴定

为构建表达H 5N 1亚型clade 2.3.4禽流感病毒(AIV)HA基因的重组腺病毒,本研究通过RT-PCR扩增A/wild duck/Shandong/628/2011(H 5N 1)的H A基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,构建重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-HA。采用A d-Easy技术,制备表达AIVHA基因的复制缺陷型重组腺病毒rAd-H A。将rA d-HA感染Ad293细胞,可产生明显的细胞病变。通过细胞超薄切片观察到完整的腺病毒颗粒。经RT-PCR、间接免疫荧光及western blot证明HA基因在A d293细胞中成功转录和表达,并且表达的蛋白具有良好的生物学活性。本研究为新型H5N1亚型AIV活载体疫苗的研发奠定了基础。

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒的遗传稳定性分析及滴度测定

研究表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组腺病毒pAd-H5的遗传稳定性及重组病毒的滴度。将重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,取第5、10、15和20代的重组病毒采用PCR方法扩增禽流感病毒HA基因,并进行基因序列分析;用标记为GFP的快速测定法计算出20代次时重组病毒的滴度。从各代重组病毒DNA中均扩增出了约1700bp的目的条带,与HA基因片段长度一致。基因序列分析表明:第5、10、15代重组病毒中的HA基因序列与原始转移载体序列完全一致,第20代重组病毒插入基因有1处发生了点突变(即HA基因417位A→G),但其编码的氨基酸未发生变化(即同义突变),表明表达的目的蛋白抗原表位未发生变化;计算出的重组病毒滴度为108.875pfu/0.1mL。重组腺病毒pAd-H5在293细胞上连续传代20次,具有良好的遗传稳定性,重组腺病毒的病毒滴度相对较高。

传染性法氏囊病活疫苗对重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1)免疫效果的影响

为评价鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗对重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1)免疫效果的影响,分别对蛋雏鸡和麻花肉雏鸡于14日龄同时接种鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)和重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1),设空白对照组(均不免疫禽流感和传染性法氏囊病疫苗)和免疫对照组(只免疫重组禽流感病毒灭活疫苗),进行法氏囊病理变化观察和血清H5N1亚型禽流感病毒抗体检测。结果显示,鸡传染性法氏囊病活疫苗均可对蛋雏鸡和麻花肉雏鸡引起法氏囊炎性反应,但对重组禽流感病毒灭活疫苗免疫抗体的产生无显著影响。

两株H1N1亚型重组流感病毒的猪致病性研究

选取2种不同宿主来源的新型甲型重组H1N1亚型流感病毒(犬流感病毒(A/canine/Guangxi/QZ5/2013)(简称CIV-QZ5)和猪流感病毒(A/swine/Guangxi/QZ5/2014)(简称SIV-QZ5),以猪为动物模型,分别以106 PFU/mL病毒剂量和气管攻毒的方式感染3周龄仔猪,从而探究新型甲型重组犬流感病毒对猪的致病性。试验发现CIV-QZ5及SIV-QZ5均能有效感染仔猪,攻毒仔猪均出现发热(≥39.5℃)、流鼻涕、食欲减退、活动减少等流感症状,其中CIV组出现1头仔猪(A3)死亡。通过对肺脏灌洗液进行病毒滴定,发现CIV组在攻毒后3d和5d在肺脏的复制能力较SIV组强,最高达到3.12log10PFU/mL。病理剖检发现,肺脏出现不同程度的实变。肺脏病理切片发现两组均出现不同病变,其中以死亡仔猪(A3)最为明显,主要以支气管上皮细胞坏死脱落,肺泡壁增厚,肺泡腔以及支气管内有大量的弥漫性浸润的单核细胞为主要特征。结果表明,猪源甲型重组CIV不仅能引发猪出现明显流感症状,而且能有效地在肺脏复制,为了解潜在的猪-犬跨宿主传播机制奠定了基础。

重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re1株)有效期的探讨

禽流感是一种严重危害养殖业发展并对人类健康存在巨大威胁的传染病。近几年在世界范围内发生了多起禽流感疫情，在国内也有部分省市发生过禽流感疫情。由于我国政府采取了积极有效的防疫措施，禽流感没有给我国养殖业造成较大的损失。而在这些积极有效的防治措施里面，高覆盖率的免疫接种是其中最为有效的措施之一，是阻止禽流感疫情发生的重要防线。由于我国禽类养殖量非常巨大，需要的禽流感疫苗的数量也就非常大，就经常需要各个疫苗生产厂家进行满负荷式的生产，即使是这样也经常满足不了市场的需要，这样各个厂家不得不进行前瞻性的战略储备。由于疫情紧张的时候市场供应经常出现断货现象，各地的兽医防疫部门为了防止疫情出现时没有足够的疫苗，也都留有一定量的储备。由于目前禽流感疫苗绝大多数为油乳剂灭活疫苗，标注的有效期为一年，在疫苗需求不紧张时期所生产的禽流感疫苗经过各个阶段的储备之后，往往就到了一年的有效期。有的省份招标疫苗要求有效期在6-8个月以上，厂家的疫苗生产计划安排十分困难，对于有效期短的禽流感灭活疫苗根本无法销售出去，不得不进行报废销毁处理，这样就造成了很大的疫苗浪费和经济损失。

DVL-1 cDNA重组质粒在N2a细胞中的瞬时表达

目的 将鼠dishevelled 1(DVL 1)cDNA重组质粒转染到培养的鼠成神经瘤细胞N2a ,建立瞬时表达系统 ,为研究Wnt信号途径在阿尔茨海默病 (AD)发病中的作用提供实验基础。方法 用常规分子生物学方法扩增、纯化DVL 1cDNA重组质粒 ,用紫外分光技术检测纯化质粒的纯度 ;用脂质体介导法将重组质粒转染入培养的鼠成神经瘤细胞N2a,用免疫印迹、免疫荧光法从蛋白质水平检测转染和表达效果。结果 质粒酶切电泳结果显示 :鼠DVL 1cD NA重组质粒PCS2 +MT MDVL1扩增和纯化成功 ,纯度达到要求 ;免疫印迹、免疫荧光结果显示外源鼠DVL 1cDNA重组质粒在鼠成神经瘤细胞N2a中获得表达 ,基因转染和表达率为 5 7 6 %。结论 成功将鼠DVL 1cDNA重组质粒转染到培养的鼠成神经瘤细胞N2a中 ,并获得瞬时表达。

禽流感灭活疫苗(H5N2,N28株)和重组禽流感灭活疫苗(H5N1,Re-1株)免疫鸡和鸭后抗体消长规律的比较研究

禽流感灭活疫苗（H5N2，N28株）和重组禽流感灭活疫苗（H5N1，Re-1株）各3批，以重组禽流感灭活疫苗（H5N1，Re．1株）推荐的免疫程序和剂量分组免疫5周龄SPF鸡和5周龄非免疫鸭。免疫后定期采集血样，测定血清HI抗体效价，分别计算各免疫组鸡和鸭HI抗体效价的几何平均数，绘制各批疫苗免疫鸡和鸭后HI效价消长曲线，并分别对两种疫苗免疫鸡和鸭后各时期的HI抗体效价进行t检验。结果为：①免疫后1周，各免疫组均未测到HI抗体；②鸡免疫后4～5周，HI抗体效价达到峰值1：2^6.0～1：2^7.0，随后2周下降相对较快，平均每周下降0．3—0．7个滴度，之后HI抗体效价缓慢下降，直到试验结束，平均每周下降0．04～0．17个滴度；③鸭首次免疫后第3周各免疫组HI抗体效价达到1：2^4.0～1：2^5.3，加强免疫（首次免疫后第3周）后，HI抗体效价迅速升高。加强免疫后第3周（首次免疫后第6周）HI抗体效价达到最高值1：2^10.6-1：2^11.7，且在峰值水平维持3周，之后1周下降相对较快，平均下降1．2～2．7个滴度，然后缓慢下降，到首免后24周平均每周下降0．28～0．39个滴度，24周除049H5N2批疫苗免疫组外，其他各批免疫鸡HI抗体效价均小于1：2^4.0；④免疫后3周内，两种疫苗刺激鸡产生的HI抗体效价均高于相应批次疫苗免疫鸭产生的HI抗体效价，免疫后第2周相差1．9—2．3个滴度，免疫后第3周相差1．6～2．0个滴度；⑤两种疫苗免疫鸡和鸭后，各时期HI抗体效价t检验差异均不显著（P〉0．05）。以上结果表明，两种疫苗免疫SPF鸡和非免疫鸭后，HI抗体效价消长规律一致，两种疫苗免疫后各个时期的HI抗体效价在统计学上差异均不显著（P〉0．05）。

MicroRNA Let-7b介导甲型流感突变型PB1重组病毒的构建

目的疫苗是预防流感所致疾病的最有效方法,MicroRNA介导的基因沉默机制为构建新型疫苗提供了新思路。文中旨在构建包含装载有miRNA Let-7b结合靶位PB1基因的甲型流感重组病毒。方法比对A/Nanjing/108/2009H1N1的PA、PB1、PB2与let-7b的靶序列选定PB1基因为最优序列后,通过基因突变,插入Let-7b的结合靶位;构建p DP2000重组表达载体,设计p DP-mu-PB1,同时设计对照组p DP-sclb-PB1,并与其余7个质粒共转染MDCK细胞和293T细胞拯救病毒;留取上清接种鸡胚尿囊腔,血凝法检测病毒,TCID50检测病毒滴度;提取病毒RNA,采用RT-PCR扩增病毒c DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列分析鉴定病毒。结果选择PB1片段最优序列(位置83 bp-107 bp),突变片段改变了3个氨基酸,同时有3个碱基不能与Let-7b靶序列配对;酶切鉴定重组质粒构建正确;重组病毒miRT(miRNA target elements)-H1N1和scramble(scbl)-H1N1的血凝效价分别为1∶32和1∶64,病毒滴度为4.68×105TCID50/m L和7.94×104TCID50/m L;测序确认突变病毒包含目的片段。结论构建成功重组病毒株,为进一步的毒力评估实验奠定了基础。

重组质粒pEGFP-N1-Srv+免疫SD大鼠后对龋齿的影响

目的:将已构建的变形链球菌表面蛋白可变区重组质粒pEGFP-N1-Srv+经不同途径免疫SD大鼠,观察其在大鼠体内的原位表达,免疫定菌鼠后的特异性抗体形成及对龋齿的影响。方法:20只SD大鼠随机分为4组,重组质粒pEGFP-N1-Srv+经股四头肌肌肉注射和下颌下腺区皮下注射2种途径免疫大鼠,免疫组化观察重组质粒的原位表达;24只SD大鼠随机分为4组,免疫途径同上,免疫剂量为100μg/只,2周后加强免疫1次。应用间接酶联免疫吸附法检测血清特异性IgG抗体和唾液特异性sIgA抗体,Keyes龋齿计分法评估磨牙的患龋情况。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:①大鼠股四头肌细胞、下颌下腺组织内均见重组质粒的阳性表达。②重组质粒pEGFP-N1-Srv+经不同途径免疫定菌SD大鼠后,可检测到血清特异性IgG抗体和唾液特异性sIgA抗体水平升高,均于首次免疫后第4周达到高峰;该时段各组间的抗体水平,实验组均显著高于对照组(P<0.01);经下颌下腺区皮下注射后的sIgA抗体水平显著高于肌肉注射组(P<0.05)。③重组质粒免疫定菌鼠后,实验组和对照组间的龋齿计分无显著差异(P>0.05)。结论:重组质粒pEGFP-N1-Srv+能够在动物体内原位表达,并能诱导SD大鼠血清特异性IgG和唾液特异性sIgA抗体增高;经下颌下腺区皮下注射后的sIgA抗体水平显著高于肌肉注射,具有一定的免疫优势。但该区域单独的龋齿预防效果不明显。

表达禽流感H5N1血凝素抗原(HA)和H9N2血凝素抗原(HA)融合基因重组腺病毒二价苗的构建

为了构建禽流感病毒H5N1亚型禽流感病毒HA和H9N2亚型禽流感HA融合基因表达的重组腺病毒。根据流行病学调查并参考文献研究结果,合成了优势流行H5N1和H9N2的保护性抗原HA基因的融合基因片段,并将该融合基因片段克隆到在pUC57载体,命名为pUC-57H5H9HA。该融合基因片段经特异酶切后与腺病毒穿梭质粒pDC315连接,获得携带目的融合基因腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA;将该重组穿梭质粒与AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒(pBHGlox(delta)E1,3Cre)经Cre/loxP酶切重组,构建成重组腺病毒(rAd-H5H9HA);Ad-H5H9HA感染293细胞后,扩增病毒基因,纯化病毒及检测病毒滴度。PCR鉴定及基因测序分析,H5N1HAH9N2HA(H5H9HA)融合基因表达的重组腺病毒载体构建成功;经过重组腺病毒r Ad-H5H9HA免疫SPF鸡后的抗体检测,证实了重组腺病毒r Ad-H5H9HA诱导了H5N1和H9N2的特异抗体,而且抗体水平达到了国家免疫标准。本研究成功构建的重组腺病毒rAd-H5H9HA,可以作为预防H5N1和H9N2两个亚型病毒的二价疫苗使用,为将来禽流感的预防控制提供了一种新的可能。

重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1型,Re-1株)抗体产生规律试验报告

通过红细胞凝集抑制试验(HI试验),对蛋用雏鸡使用重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1型,Re-1株)和某种禽流感重组二联活疫苗的不同免疫程序的免疫效果进行监测,掌握禽流感HI抗体产生及消长规律,制定适合的种鸡和商品蛋鸡预防高致病性禽流感的免疫程序和免疫规范。

重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株在MDCK悬浮细胞中培养条件的优化

目的:探索重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株的最佳培养条件,为规模化生产提供参数。方法:通过分析病毒培养液的血清浓度、温度、pH、胰酶终浓度和病毒接种量、收获时间来优化病毒在MDCK上的最佳培养条件。结果:重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株在MDCK悬浮细胞上增殖的最佳培养条件为按接种量MOI 10^(-3),于胰酶终浓度为5μg/L、温度35.0℃、pH7.3±0.1的无血清病毒培养液中培养,收获时间为48~60 h,以48 h最佳。