应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体

RNA干扰是近年来生物技术领域新兴的研究热点之一。在作物的研究中,RNA干扰被认为在作物品质改良中具有重要的应用价值,并已在水稻、小麦、玉米等作物中得到成功应用,但在大豆的研究中尚鲜有报道。在研究植物RNA干扰的实验中,构建相应的RNA干扰表达载体是常用手段,但传统构建方法较费时费力。重组PCR是一种利用重叠延伸的方法进行高效和快速的体外基因片段拼接的PCR技术。研究将重组PCR技术应用于构建大豆脂肪氧化酶基因ihpRNA干扰表达载体,一方面探索一条更简便、快捷、适应范围更广泛的大豆基因RNA干扰表达载体构建方法,另一方面所构建的载体为进一步研究RNA干扰在大豆脂肪氧化酶改良中的应用奠定了基础。结果显示应用重组PCR技术构建大豆脂肪氧化酶基因RNA干扰表达载体是可行的,相比与常规方法此方法更简便、快捷、效率更高。

重组PCR技术研究进展和应用

重组PCR是用聚合酶链反应体系来实现DNA重组的技术。经过20多年的发展,该技术已形成三个各具特色的方法分支:重叠延伸拼接、跳跃PCR和DNA重排。近几年,以利用天然的差异基因作为重组来源为目的,通过简化操作步骤、提高捕获变异的效率、借助于表面展示技术和荧光探针技术搭建的高通量筛选平台,重组PCR技术在基础研究和工程应用研究的众多领域中的实用价值不断增加。

应用重组PCR技术构建人单链白细胞介素12融合基因

目的构建人单链白细胞介素 12 (hsc IL- 12 )融合基因并在真核细胞中进行表达 ,为进一步研究 hsc IL- 12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法应用重组 PCR技术将 h IL - 12 p40和 p35亚单位两段编码序列的 c DNA通过一疏水性多肽接头 (Gly4Ser) 3碱基序列进行前后拼接 (IL- 12 p40 -多肽接头 - p35 ) ,构建 hsc IL- 12融合基因 ,并进行核苷酸序列测定 ,进一步将 hsc IL - 12融合基因插入 pc DNA3.1真核表达载体中 ,转染 COS- 7细胞表达 hsc IL - 12融合蛋白 ,并行 Western blot分析。结果该融合基因经 DNA序列分析表明 :p40、p35、linker的连接顺序、方向及序列完全正确 ,融合基因可在 COS- 7细胞中表达hsc IL- 12融合蛋白。Western blot显示该融合蛋白分子量为 70 0 0 0 u,可与鼠抗人 IL- 12 p40 /p70单克隆抗体特异性结合。结论重组 PCR技术是十分有效。

重组PCR——一种快速体外基因重组技术

重组PCR是一种用于体外进行基因重组的简单、高效、快速技术 ,在基因重组过程中 ,不受载体和待连接DNA片段内部自身酶切位点的制约 ,连接时不依赖于限制性内切酶和连接酶 ,具有传统的DNA重组技术无法比拟的优势。

应用体外重组PCR技术构建Ppdc-ldh融合基因

利用重组PCR技术连接分别从干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC334中扩增的乳酸脱氢酶基因(ldh)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)CP4中扩增的丙酮酸脱羧酶基因启动子(Ppdc)片段,构建了Ppdc-ldh融合基因。并将其克隆到pMD19-T载体上,再转化到大肠杆菌DH5α中,得到阳性克隆质粒pT-Ppdc-ldh。序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框,具有起始密码子GTG和终止密码子TAA,启动子的-35区和-10区序列与起始密码子之间的距离没有改变,可以插入到原核表达载体中进行表达。

重组PCR技术的应用及优化

重组PCR是通过DNA重叠序列的衔接作用,使多个DNA分子融合在一起的体外扩增技术。它使基因全序列的拼接、基因融合、基因破坏及启动子交换等DNA操作变得简单易行。如今重组PCR已成为DNA分析的有效利器。本研究通过重组PCR在分子进化、基因敲除及基因敲入、启动子研究和转基因植物转化载体的构建等方面的实际应用,分析了该技术的影响因素,并针对引物设计、DNA碱基重叠长度、温度参数等重要反应条件提出了优化方案。

利用重组PCR技术构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体

[目的]构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体。[方法]利用含有GFP基因和Nos终止子的A2GFP质粒和含有普遍适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子(Ptrpc)的pUCATPH质粒,通过重组PCR技术构建Ptrpc-GFP-Nos重组基因,然后插入到农杆菌质粒pCAMBIA 1300的多克隆位点,构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体,并对其进行酶切和测序鉴定。[结果]通过重组PCR技术,仅通过Ptrpc启动子基因扩增、GFP-Nos基因扩增、Ptrpc-GFP-Nos重组基因扩增、1次双酶切、1次连接和转化,就成功地构建了适合真菌ATMT转化的GFP基因的表达载体pCAMBIA 1300-PGN,不需要构建中间载体,并大大简化了连接步骤。该载体经过PCR、酶切和测序鉴定,结构正确,连接准确,序列无误。[结论]该研究为真菌ATMT突变体的构建和快速检测奠定了基础。

应用重组PCR构建猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白融合基因

膜联蛋白A2是膜联蛋白多基因家族成员之一,在Ca2+存在时能与带负电荷的磷脂结合。最近研究显示,膜联蛋白A2在病毒感染方面发挥了重要作用。本研究应用RT-PCR和PCR方法分别获得了猪源膜联蛋白A2和增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)。然后用重组PCR技术成功构建了膜联蛋白A2-EGFP融合基因,为研究膜联蛋白A2在病毒感染细胞中的定位和表达,以及病毒和宿主细胞相互作用奠定了基础。

利用重组PCR技术构建大肠杆菌肠毒素LT_B0ST_I融合基因

利用重组PCR技术将从原始菌种中扩增得到的LTB、STI 基因片段连接起来 ,构建了LTB STI 融合基因。并将其克隆到 pUCm T载体上 ,转化到大肠杆菌DH5α中 ,得到克隆T LS ,序列分析表明该克隆具有正确的基因序列和阅读框 ,具有起始密码子ATG和终止密码子TAA 。

应用体外重组PCR技术构建鸡单链抗体基因的研究

用异硫氰酸胍与β_巯基乙醇联合变性的方法 ,从罗曼鸡脾脏中提取总RNA ,RNA样品经紫外检测后 ,A2 3 0=0 .0 715 ,A2 60 =0 .15 18,A2 80 =0 .0 793;根据莱航鸡免疫球蛋白的轻、重链可变区基因的骨架区 1和骨架区 4的序列 ,分别设计一对引物 ,通过反转录_PCR方法 ,分别扩增出了罗曼鸡的轻、重链可变区基因 ,1.5 %的琼脂糖凝胶电泳图谱显示其大小分别约为 36 0bp和 4 2 0bp ;以VL 和VH 为模板 ,借助重组PCR手段 ,构建了VL_Linker_VH 形式的鸡单链抗体 ,1.5 %的琼脂糖凝胶电泳图谱显示出一条约 780bp区带。为进一步构建鸡的噬菌体抗体库和筛选特异性的鸡单链抗体打下了基础。

重组PCR构建bcr-abl mRNA竞争RT-PCR内标物

目的竞争ＰＣＲ可用于ｍＲＮＡ的定量测定，为了得到白血病中ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ定量ＰＣＲ的竞争内标物。方法利用重组ＰＣＲ技术，实施对ｂ３ａ２型ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ中一２７６ｂｐ片段的缺失法定点突变。结果经ＤＮＡ序列分析证实，重组后的ｃＤＮＡ片段与重组前相比，５′和３′端大部分序列相同，仅中间５５ｂｐ的部分序列缺失，同时引入１９ｂｐ外源ＤＮＡ片段，即净缺失３６ｂｐ，得到２４０ｂｐ的重组ＰＣＲ产物。较ｂ２ａ２型ｂｃｒ－ａｂｌｃＤＮＡ相应的２０１ｂｐ扩增片段长３９ｂｐ，使之适于作为ｂ３ａ２和ｂ２ａ２型两类ｂｃｒ－ａｂｌｍＲＮＡ定量ＰＣＲ的通用内标物。

一种载体构建的新方法:重组融合PCR法

本研究介绍一种多目的片段一步重组克隆的载体构建的新方法。该方法要求在PCR引物设计时,在第一个目的片段上游引物的5'端和最后一个目的片段下游引物的5'端各设置16bp与线性化目标载体末端同源的序列,再在各目的片段之间的引物上各设计25bp的重叠序列,以便进行融合PCR将多片段扩增成融合片段。此方法将融合片段与线性化骨架载体进行一步重组、转化和重组子鉴定。该方法只要求骨架载体上有一个特异性酶切位点,特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建;该方法还可以引入定点突变,可便捷构建分析启动子功能等需引入定点突变的载体;该构建方法还可以实现多基因的无缝融合构建多顺反子,在构建原核基因表达载体、叶绿体表达载体、线粒体表达载体方面有着明显优势。本研究以水稻胚乳特异性表达载体PGt1-mGFP-pSB130为例,介绍此载体构建方法。

人巨细胞病毒重组基因表达质粒的构建

目的 用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入pPIC9K质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法 根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋白pp15 0C末端的cDNA序列 ,设计出 2对引物。利用PCR的方法 ,以病毒培养液上清为模板 ,进行二轮PCR扩增 ,把两个目的基因串联在一起 ,将所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,筛选出阳性转化子 ,并用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果 从人巨细胞病毒培养液上清中扩增出目的基因 ,PCR反应和双酶切鉴定结果与预期相符。

重组牛乳铁素融合蛋白的原核表达及其抑菌活性分析

为建立生物合成牛乳铁素的方法,根据牛乳铁素氨基酸序列确定其编码序列,利用PCR技术获得基因扩增产物,接着将该产物与编码鱼腥蓝细菌Anabaena sp.PCC7120的DNA聚合酶基因dnaENI中断裂的内含肽基因Asp dnaEIn的PCR产物进行重组PCR,将获得的重组融合基因再克隆到表达载体pET-28a构建重组融合表达质粒。结果显示,融合表达质粒转化大肠杆菌后经诱导能在大肠杆菌表达宿主Escherichia.coli BL21(DE3)中大量表达,且细胞裂解液与纯化的Anabaena sp.PCC7120中含断裂内含肽Asp DnaEIc的DNA聚合酶蛋白DnaECI混合反应后对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。

增强型绿色荧光蛋白eGFP基因与犬瘟热N蛋白基因重组质粒的构建

【目的】构建增强型绿色荧光蛋白(e GFP)基因与犬瘟热核蛋白N基因(CDV N)的重组质粒,为获得犬瘟热重组病毒的感染性克隆奠定研究基础。【方法】设计重组PCR引物,分别扩增e GFP,CDV N基因,并融合重组基因。【结果】成功克隆了e GFP基因和CDV N基因,大小分别为720 bp和1 572 bp,经测序鉴定与Gen Bank中已发表的e GFP(登录号:X83959)和CDV N(登录号:AY466011)序列同源性分别为100%和99.81%。重组基因e GFP-CDV N大小为2 292 bp,与预期大小一致。【结论】采用重组PCR技术构建的Te GFP-CDVN重组质粒,可用于e GFP-CDVN重组蛋白的表达。

狂犬病病毒SRV_9株磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因重组质粒的构建

【目的】重组狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白的P基因和基质蛋白的M基因,为构建狂犬病毒(SRV9)全长c DNA提供技术支撑。【方法】设计重组PCR引物,分别扩增SRV9的P基因和M基因,构建重组质粒p MD18-PM,并对重组质粒进行酶切、测序鉴定。【结果】PCR扩增的SRV9的P基因和M基因大小分别为893 bp和608 bp,与Gen Bank已发表的狂犬病病毒SRV9(登录号:AF499686)序列比较,同源性分别为99.66%和99.67%。融合基因PM片段大小为1 501 bp,与预期大小相同,且融合完全。【结论】应用重组PCR成功融合狂犬病病毒SRV9磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因,为后续构建病毒全长c DNA及感染性克隆奠定基础。

J-HNP-1多肽的重组及体外抗菌作用研究

目的:将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因进行重组使其成为一种新的杀菌肽分子J-HNP-1,并将其构建于能有效表达和分泌活性J-HNP-1杀菌肽的哺乳动物细胞表达系统．方法:应用PCR技术从不同的质粒中获得J链基因和 HNP-1基因,然后应用重组PCR技术将这两个不同的基因连接在一起而成为J-HNP-1基因．将此基因克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3．1(-)／Myc-HisC中．用脂质体转染法将此重组子导入COS-7细胞,分别从 mRNA和蛋白质水平采用RT-PCR和Western blot分析 J-HNP-1的表达情况,并体外检测细胞可溶性蛋白及培养上清的抗菌活性．结果:获得的J链基因和HNP-1基因大小分别为489和 297 bp．采用RT-PCR法从被转染的细胞中扩增出一条约786 bp的片段,其大小与预测相符;采用Western blot 印迹法．用抗His抗体检测到细胞可溶性蛋白及培养上清在约Mr 24 000处有强反应条带显示;抗菌活性检测显示,经rpcDNA3．1(-)／Myc-HisC／J-HNP-1转染的 COS-7细胞的可溶性蛋白和培养上清均有明显的抗菌活性,抑菌圈的直径分别为34和43 mm．结论:重组J-HNP-1基因构建到哺乳动物细胞表达系统,并体外表达,具有抑菌作用．

白蚁纤维素酶结构域重组研究

对来源于白蚁Nasutitermes takasagoensis的纤维素酶NtEG和来源于Thermomonospora fusca的耐热性纤维素酶E4进行同源建模和序列比较,利用重组PCR技术将E4的结合域与NtEG的催化域进行结构域重组,形成重组纤维素酶。并将得到的重组体置于毕氏酵母X33中表达并检测其催化效率。结果表明:重组纤维素酶的相对分子质量约为59 ku;用羧甲基纤维素法、滤纸法、微晶纤维素测得重组纤维素酶的活性分别为17.1、5.4、4.6 U/mL;重组纤维素酶可在毕赤酵母中成功表达。

弓形虫主要表面抗原P30两个不同片段的重组表达、纯化及应用

目的将刚地弓形虫(简称弓形虫)主要表面抗原P30基因两个不同片段重组表达,纯化所获重组蛋白用于弓形虫病免疫学诊断。方法根据弓形虫P30基因的全长序列,用PCR法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段,并构建相应克隆进行诱导表达,表达蛋白以western blot鉴定。用Amylose Resin以亲和层析法纯化所表达的蛋白。以弓形虫RH株感染家兔,用粗抗原和纯化重组抗原以ELISA法比较检测各种寄生虫病患者、感染家兔血清及疟原虫感染小鼠血清。结果1.成功构建相应克隆,并成功诱导表达,表达产物经纯化后获得高纯度目的蛋白。2.重组抗原与粗抗原相比,具有相同的敏感性和更高的特异性。结论成功获得弓形虫主要表面抗原P30的2个表达产物,以此重组抗原与粗抗原对比检测弓形虫相应抗体,结果证明重组抗原特异性高于粗抗原。