脂质体介导下重组pcDNA3-hBMP3转染兔关节软骨细胞的条件

目的 探讨基因转移效率与 pc DNA3- h BMP3质粒及阳离子脂质体的浓度、转染时机以及细胞的种殖密度等因素的关系 ,以寻求最佳的基因转染条件 .方法 细胞密度按 2× 10 4· cm- 2 接种后 ,对细胞接种后即时、孵化 2 ,5和 7d进行转染效率研究 ;G418浓度每 m L DMEM分别含有 2 0 0 ,30 0 ,40 0 ,5 0 0和 6 0 0μg,探讨 G418对软骨细胞的杀伤作用 ;选择不同细胞接种密度、不同脂质体浓度和 pc DNA3- BMP3浓度 ,在细胞对数生长期且细胞融合至 70 %～ 80 %时开始做转染 ,各组软骨细胞爬片的原位杂交结果通过计算机图像分析 ,以其灰度值判定基因转染的效率 .结果 最佳期的转染时机为软骨细胞接种后在孵箱内放置 2 d转染 ,即在软骨细胞对数生长期内做转染 .G418对软骨细胞的最佳筛选浓度为 40 0 mg· L- 1 .最佳的细胞种植密度、pc DNA3- BMP3浓度和脂质体的量应分别为 2× 10 4· cm- 2 ,5 μL 和 10 μL.结论 通过本研究探索出脂质体介导下 pc DNA 3- BMP3转染兔关节软骨细胞的最佳条件 .

重组PcDNA3-hBMP3转染兔关节软骨细胞和对其增殖的影响

目的研究将人骨形成蛋白３（ＢＭＰ３）的ｃＤＮＡ构建于真核，表达载体ＰｃＤＮＡ３，形成重组ＤＮＡ ＰｃＤＮＡ３－ｈＢＭＰ３，转染兔关节软骨细胞，以探讨基因转染对关节软骨细胞增殖的影响。方法利用重组ＤＮＡ和基因克隆技术构建重组ＤＮＡ；用细胞培养和基因转染技术体外转染兔关节软骨细胞；用核酸杂交和蛋白电泳检测细胞ＢＭＰ３的表达，最后通过ＦＣＭ、ＤＮＡ和葡糖醛酸含量检测以及Ⅱ型胶原探针原位杂交分析其对增殖的影响。结果软骨细胞６次传代后，Ⅱ型胶原原位杂交的灰度值降低，同样条件下转染的软骨细胞仍保持较高水平Ⅱ型胶原的表达；转染的软骨细胞经流式细胞仪的分析，软骨细胞Ｓ期细胞比例增多，说明细胞ＤＮＡ的合成增加；经ＤＮＡ和葡糖醛酸含量测定，转染的软骨细胞ＤＮＡ和葡糖醛酸含量较转染前有明显提高。结论ｈＢＭＰ３对维持软骨细胞的表型具有十分重要的作用，在脂质体的介导下，ＤＮＡ ＰｃＤＮＡ３－ｈＢＭＰ３转染兔关节软骨细胞获得成功。

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的 :构建人骨形态发生蛋白 2 (humanbonemorphogeneticprotein ,hBMP 2 )真核表达载体PcDNA3 1 hBMP 2 ,转染兔骨髓基质干细胞 (bonemarrowstromalcells ,BMSCs) ,种植去抗原牛松质骨(bovinecancellousbone ,BCB)支架体外构建组织工程骨。方法 :蛋白印迹法检测转染后细胞BMP 2的表达 ,碱性磷酸酶 (ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上 ,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 :转染后 ,BMSCs表达BMP 2 ,ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀 ,伸展良好。结论 :在脂质体介导下 ,BMP 2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化 ,转染后细胞在支架材料上贴附生长良好 ,为进一步应用携带BMP

重组质粒pcDNA3-β-NGF的构建及其转染小鼠骨髓间充质干细胞生物学活性的研究

目的:构建人神经生长因子β亚基(β-NGF)真核表达载体,转染荧光小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学活性。方法:全骨髓贴壁培养法分离、培养和纯化荧光小鼠MSCs,构建真核表达载体pcDNA3-β-NGF,并转染MSCs;免疫组织化学染色检测β-NGF的表达,观察β-NGF阳性的MSCs对小鼠海马神经元生长的作用。结果:荧光小鼠MSCs可发出明亮的绿色荧光,且荧光不随培养时间延长和传代次数增加而衰减。重组质粒pcDNA3-β-NGF转染MSCs后β-NGF阳性率为(37.12±2.14)%,高于MSCs组[(2.36±0.62)%]和空白对照组[(1.43±0.76)%],差异有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3-β-NGF转染MSCs上清液培养的新生小鼠海马神经元的突起长度[(31±3)μm]较pcDNA3转染MSCs组[(23±4)μm]明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),表明β-NGF基因转染MSCs培养上清液中的产物能促进小鼠海马神经元的突起生长,具有明显的生物学活性。结论:成功构建了pcDNA3-β-NGF真核表达载体,其转染的荧光小鼠MSCs能正确、稳定表达和分泌有生物学活性的β-NGF。

pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞的体外表达及体内成骨能力(英文)

背景:能否通过病毒或者非病毒载体将骨形态发生蛋白2转导到骨髓基质细胞发挥成骨作用?目的:观察真核表达载体pcDNA3-hBMP2转染兔骨髓基质细胞后体外表达,同时将MSC转染后但未筛选兔骨髓基质细胞自体回植入肌组织,利用X线观察其成骨情况。设计、时间及地点:观察对比实验。实验于2004-11/2005-04在辽宁医学院骨科研究室完成。材料:6只成年新西兰大白兔,雌雄不拘,体质量2.0～3.0kg。BMP2抗体为美国Sanaka公司产品,pcDNA3-hBMP2由解放军第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供,限制性内切酶购于大连宝生物工程有限公司。方法:从大肠杆菌提取超纯质粒pcDNA3-hBMP2,从成年兔股骨抽取骨髓,密度梯度分离法分离培养骨髓基质干细胞,将细胞分成4组:A组:pcDNA3-hBMP2转染进行G418筛选;B组:pcDNA3-hBMP2转染未用G418筛选;C组:给予pcDNA3空载体转染;D组:仅加入脂质体转染试剂Fugene6。主要观察指标:①应用免疫组织化学法检测转染后瞬时表达。②应用免疫组织化学法检测细胞骨钙素表达,分别应用原位杂交法检测细胞Ⅰ型胶原表达。③转染2周后将B组细胞自体回植入兔后腿肌组织中,移植4周后应用X射线观察成骨情况。结果:①pcDNA3-hBMP2成功转染入骨髓基质干细胞内并100%瞬间表达BMP2。②基因转染4周后,A组细胞骨钙素及Ⅰ型胶原表达高于C组及D组。③B组细胞回植肌组织4周后,X射线可显示新骨形成。结论:pcDNA3-hBMP2能安全有效转染兔骨髓基质干细胞,通过其分泌物BMP2来作用诱导细胞加速分化为成骨细胞。

重组质粒pcDNA3-gtfB在哺乳动物细胞中的表达

目的 :检测含有变形链球菌葡糖基转移酶抗原基因 (gtfB)的重组质粒pcDNA3_gtfB能否在哺乳动物细胞COS_1中正确地转录和表达。方法 :采用脂质体介导法 ,将pcDNA3_gtfB转染哺乳动物细胞COS_1,采用RT_PCR法、免疫组化LSAB法、Western免疫印迹法检测重组质粒的转录水平和表达产物。结果 :pcDNA3_gtfB在转染COS_1细胞后具有转录和翻译活性 ,蛋白质表达产物分子量为 116～ 2 12kD ,且可与兔抗葡糖基转移酶抗体发生特异性结合。结论 :重组质粒pcDNA3_gtfB在哺乳动物细胞中能正确地转录和表达 。

人骨形态蛋白-3基因真核表达载体(PcDNA3-hBMP3)构建

０引言人骨形态蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）可诱导多种来源的未分化间充质细胞向软骨细胞和成骨细胞转化，进而形成新骨，而且对软骨细胞也有促进分裂和增殖的作用，促进后者Ⅱ型胶原和氨基多糖（ＰＧ）的分泌．转基因技术和真核表达载体的产生为软骨细胞库建立和开展软骨组...

日本血吸虫真核表达重组质粒pcDNA3-Sj26的构建及其在树突状细胞中的表达

本研究构建日本血吸虫2 6kDa谷胱苷肽转移酶(Sj2 6 )基因的真核表达重组质粒(pcDNA3 Sj2 6 ) ,并探讨其在树突状细胞(DC)中的表达。采用PCR扩增Sj2 6基因片段,定向克隆至真核表达载体pcDNA3中,阳性克隆经双酶切、PCR扩增鉴定后,双脱氧链末端终止法进行序列测定。用脂质体介导DNA转染法将pcDNA3- Sj2 6转染DC ,G4 18加压筛选获得阳性克隆并传代培养,用RT PCR检测Sj2 6mRNA的转录水平,用SDS- PAGE、Westernblot和间接免疫荧光法检测Sj2 6蛋白在DC中的表达。结果PCR扩增得到特异的Sj2 6基因片段,双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3 -Sj2 6重组质粒;测序结果表明,核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank报道的Sj2 6的一致性均为99% ;RT PCR结果显示pcDNA3- Sj2 6转染的DC中有Sj2 6基因mRNA的表达,SDS -PAGE和Westernblot、间接免疫荧光法显示pcDNA3- Sj2 6转染的DC中有Sj2 6的表达。结果证实构建的真核表达重组质粒pcDNA3- Sj2 6成功的转染至DC中并在DC中获得表达。

培养基对重组质粒pcDNA3-HGF产率的影响

重组质粒DNA用于基因治疗需要大量符合药学规格的质粒DNA ,发酵是影响质粒产率的关键步骤之一。比较了 4种不同的培养基对pcDNA3 HGF产率的影响 ,其中自配复合培养基 (ZP)质粒产率最高 ,而LB培养基的质粒产率最低 ,5L发酵罐发酵最终pcDNA3 HGF产率达 72mg L 。

弓形体重组质粒pcDNA_3-SAG1免疫小鼠诱导的细胞免疫应答研究

目的 :用 pc DNA3- SAG1真核表达质粒直接免疫小鼠 ,观察 DNA免疫所诱导的小鼠细胞免疫应答 ,为研制弓形虫疫苗奠定基础。方法 :大量制备重组质粒 pc DAN3- SAG1,然后将其导入 BAL B/ c小鼠体内 ,每隔 2 1d接种一次 ,一共免疫三次。用 MTT方法对脾脏的 NK细胞和其淋巴细胞的转化率进行测定 ;采用免疫荧光法对 CD4+、CD8+ 细胞进行测定。结果 :实验组 NK细胞杀伤率为 :70 .0± 3.6 4,而 pc DNA3及空白对照分别为 :48.5± 6 .0 8和 47.0± 5 .93。实验组 NK细胞活性比对照组明显增高 (P<0 .0 5 ) ,而 pc DNA3质粒及空白对照组差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;对 T淋巴细胞亚群 CD4+、CD8+进行动态分析 ,可见随着感染时间的延长 ,CD8+的数量逐渐上升 ,CD4+ / CD8+的比率逐渐下降 ,实验组与 pc DNA3质粒及空白对照有明显差异 (P<0 .0 5 ) ;Con A刺激小鼠淋巴细胞转化实验 ,能刺激免疫鼠及对照鼠淋巴细胞增生 ,实验组与 pc DNA3质粒及空白对照组差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论 :重组质粒pc DNA3- SAG1免疫 BAL B/ c小鼠可诱导一定的细胞免疫。

重组质粒pcDNA3/sTNFR(p55)转染牙龈成纤维细胞的瞬时表达检测

目的检测重组质粒pcDNA3/sTNFR(p55)对人牙龈成纤维细胞的转染效率及瞬时表达。方法人牙龈成纤维细胞体外原代培养并传代,重组质粒用脂质体包裹介导进行体外转染。双抗体夹心ELISA法对重组质粒在人牙龈成纤维细胞中表达产物的含量进行检测。结果人可溶性肿瘤坏死因子受体[sTNFR(p55)]在基因转染24 h后开始表达,72 h最高,转染组细胞培养液和冻融液中sTNFR(p55)表达量均高于对照组(P<0.05),1周后表达逐渐减弱,2周后仍有少量表达。结论重组质粒pcDNA3/sTNFR(p55)在人牙龈成纤维细胞系中具有表达功能,并且在细胞外及细胞内均具有特异性表达产物。

重组质粒pcDNA3/sIL-1R(Ⅰ)转染牙龈成纤维细胞的瞬时表达检测

目的 检测以sIL 1R胞外成熟肽编码区基因作为目的基因构建的重组质粒pcDNA3/sIL 1R(Ⅰ )对人牙龈成纤维细胞的转染效率及瞬时表达量 ,为pcDNA3/sIL 1R(Ⅰ )导入动物牙龈组织提供依据。方法 人牙龈成纤维细胞体外原代培养并传代 ,重组质粒用脂质体包裹介导进行体外转染。ELISA法对重组质粒在人牙龈成纤维细胞的表达产物进行含量检测。结果 sIL 1R(Ⅰ )在基因转染 2 4h内开始表达 ,72h最高 ,转染组细胞培养液和细胞冻融液中sIL 1R表达量均显著高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,1周后表达逐渐减弱 ,2周后仍有少量表达。结论 通过脂质体介导的基因转染方法 ,重组质粒pcDNA3/sIL 1R(Ⅰ )在人牙龈成纤维细胞系中具有表达功能 。

重组质粒PcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B在Hela细胞中表达的研究

目的观察重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 在 Hela 细胞中的表达情况,并检测其表达的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 免疫学活性。方法脂质体介导重组真核表达质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 转染 Hela 细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,收集蛋白行 SDS-PAGE 和 Westem-Blot 分析,检测融合蛋白的免疫学活性。结果经重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B 稳定转染的 Hela 细胞表达了分子量约64KD 的融合蛋白,经 Western-Blot 检测证实该融合蛋白具有 P30免疫原性。结论在HeLa 细胞中成功表达了具有 P30免疫原性的融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B,为下一步动物实验奠定了基础。

hGPR177/PCDNA3.1(+)重组质粒的构建及其在A549肺癌细胞中的表达

目的构建hGPR177/PCDNA3.1(+)重组质粒,并在A549肺癌细胞中表达hGPR177蛋白。方法利用生物分析软件DNAMAN6.0选取合适的穿梭载体PCDNA3.1(+)和酶切位点。用质粒提取试剂盒对穿梭载体PCDNA3.1(+)及含有hGPR177基因pReceive-B04质粒进行抽提,并对其进行双酶切。使用DNA连接酶把hGPR177基因与PCDNA3.1(+)酶切片段连接,重新构建hGPR177/PCDNA3.1(+)重组质粒。将重组质粒通过电转的方式转导进A549肺癌细胞。运用细胞培养技术,培养已电转hGPR177/PCDNA3.1(+)重组质粒的A549肺癌细胞。结果利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测hGPR177/PCDNA3.1(+)重组质粒的质量为6999bp。经过机械破碎后获取细胞提取物,电泳鉴定出现GPR177蛋白带。结论成功构建了hGPR177/PCDNA3.1(+)重组质粒,并在A549肺癌细胞表达系统中表达出人GPR177蛋白。

弓形虫主要表面抗原p30单价及复合基因疫苗的构建

目的 构建弓形虫单价基因疫苗 pcDNA3 1 p3 0及复合基因疫苗 pcDNA3 1 p3 0 ROP2 ,并比较两种疫苗对小鼠的免疫保护性。 方法 用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增编码弓形虫主要表面抗原 p3 0和弓形虫棒状体蛋白 2 (ROP2 )的基因片段 ,经T A克隆 ,将p3 0单价基因及 p3 0 ROP2复合基因片段分别插入真核细胞表达载体pcDNA3 1,构建重组真核表达质粒 pcDNA3 1 p3 0及pcDNA3 1 p3 0 ROP2。分别免疫BALB/c小鼠 ,设磷酸缓冲盐溶液 (PBS)组、pcDNA3 1空质粒组为对照 ;酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测血清特异性IgG抗体 ;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。 结果 获得 pcDNA3 1 p3 0、pcDNA3 1 p3 0 ROP2重组表达质粒 ,用 pcDNA3 1 p3 0 ROP2免疫的小鼠 ,其IgG抗体吸光度 (A490 =2 0 5 1± 0 3 3 7)高于用 pcDNA3 1 p3 0的吸光度 (A490 =1 892± 0 3 69) (P <0 0 5 )。攻击感染弓形虫后小鼠生存时间 ,用 pcDNA3 1 p3 0 ROP2免疫的小鼠 ,较用 pcDNA3 1 p3 0的明显延长 (P <0 0 1)。 结论 弓形虫不同生活阶段的抗原复合基因疫苗较单价基因疫苗具有更好的免疫保护性。

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子(NGF)基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法:采用RT-PCR的方法扩增蛇毒NGF的基因片段,将目的基因、真核表达载体pcDNA3.1(-)分别酶切后回收,连接、转化而构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,经酶切和测序对重组体进行鉴定。利用脂质体Lipofectamine～(TM) 2000方法转染NIH3T3细胞,对阳性克隆裂解上清中NGF的表达用SDS-PAGE、Western-blot的方法检测。结果:重组载体经酶切、测序分析,插入的基因片段为表达蛇毒NGF的基因,NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,并检测出在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步开展NGF基因治疗神经系统的疾病奠定了实验基础。

p75真核表达载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的:构建人神经生长因子低亲和力受体p75真核表达质粒,并在前列腺癌细胞PC3中表达。方法:运用RTPCR技术从人脑胶质细胞瘤组织中分离扩增编码人p75完整基因,与pcDNA载体重组,并通过酶切和测序鉴定;用脂质体介导法将重组质粒转染到PC3细胞中,经G418筛选后,用RTPCR、间接免疫荧光化学和细胞免疫组织化学法在转录和翻译两个水平上检测表达产物。结果:酶切和测序证实所获得的重组质粒包含-p75完整基因;在转染pcDNA3.1(+)-p75的PC-3细胞中检测到转录和翻译产物。结论:成功地构建了-p75真核表达质粒并在PC-3细胞中表达,为深入研究p75在前列腺癌中的生物学功能奠定了基础。

人类14-3-3β真核表达系统的构建

目的:构建人类14-3-3β基因真核表达载体并观察其转染的ECV-304细胞中14-3-3β的表达。方法:用基因重组技术将人类14-3-3βcDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导转染ECV-304细胞,Western-blot检测其在细胞内的表达。结果:酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3.1-14-3-3β表达质粒克隆成功,经Westem-blot检测14-3-3β蛋白在ECV-304细胞中获得表达。结论:以脂质体介导pcDNA3.1-14-3-3β质粒转染真核细胞为进一步研究14-3-3β基因的功能奠定了实验基础。

弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A_2/B复合基因真核表达质粒的构建

目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B 质粒中扩增编码 P30、P22基因片段和 CTXA_2/B,定向重组入 pUC18克隆载体,然后酶切释放 P30-P22-CTXA_2/B 复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉素的 LB 培养基筛选、酶切及测序鉴定。结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和 CTXA_2/B 基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp 的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确。结论成功地构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础。

PcDNA3-hBMP3基因转染关节软骨细胞及其稳定表达

目的探讨外源性基因ｈＢＭＰ３在软骨细胞获得稳定表达的可能性。方法将人ＢＭＰ３的ｃＤＮＡ构建于真核表达载体ＰｃＤＮＡ３，形成重组真核表达载体ＰｃＤＮＡ３ｈＢＭＰ３，转染培养状态下兔关节软骨细胞。利用重组ＤＮＡ和基因克隆技术构建重组真核表达载体ＰｃＤＮＡ３ｈＢＭＰ３；利用细胞培养和细胞基因转染技术体外转染ｈＢＭＰ３基因至关节软骨细胞；利用核酸提取（ＮｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ）和核酸杂交技术检测细胞转染后４周ｈＢＭＰ３基因的表达情况。结果兔关节软骨细胞属贴壁生长，呈多角形，细胞一代时间５天，指数生长期为接种后２～４天。ＰｃＤＮＡ３ｈＢＭＰ３用ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ双酶切下的片段和λＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒｓ于１５％琼脂糖电泳，为５４ｋｂ和１４ｋｂ，符合各自的物理图谱，表明构建重组基因成功。细胞转染后用Ｇ４１８筛选至４周，仍有新的细胞克隆形成，提取克隆细胞的ｍＲＮＡ做斑点杂交，结果显示阳性。结论在脂质体的介导下，重组真核表达载体ＰｃＤＮＡ３ｈＢＭＰ３转染兔关节软骨细胞且获得了稳定表达。