中国黄牛重组PrP^c成熟蛋白单克隆抗体的研制

将纯化的牛重组PrPc 成熟蛋白免疫PrPc 基因敲除小鼠 (PrPc-nullmice) ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,经一次融合 ,共筛选出3株能稳定分泌针对中国黄牛PrPc 成熟蛋白特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D5、5C10和3F3。免疫印迹试验表明 :腹水单抗4D5、5C10和3F3均可特异识别重组中国黄牛PrPc

家鸡Leptin成熟肽cDNA的克隆、重组蛋白表达及纯化

从 18周龄鸡卵巢组织中抽提总 RNA,使用六聚体随机引物反转录后 ,用鸡 L eptin(瘦素 )特异性引物扩增出鸡L eptin编码区第 5 2～ 4 6 0 bp的长度为 4 0 9bp的 c DNA片段。根据鸡 L eptin的 3′端第 4 6 0～ 4 92 bp序列设计了 3条部分相互重叠并且顺序串联延伸的下游反义引物 ,并在最后 1条引物 3′端连接上 Eco R 切点 ;在以上用于反转录扩增的 5′端引物的 5′端连接一 Bam H 切点。用该 5′端引物分别与 3个 3′端引物配对 ,利用反转录扩增出的 4 0 9bp的L eptin c DNA片段作为第 1模板进行扩增 ,扩增产物再作为模板与下一引物对再次扩增。经 3次扩增得到编码鸡 L ep-tin成熟肽的全长 4 5 1bp的 c DNA序列。将该 4 5 1bp的 L eptin c DNA序列经 Bam H 和 Eco R 双酶切后 ,克隆入表达质粒 p RSET A的 Bam H 和 Eco R 两酶切位点之间 ,构建成表达质粒 p L ep- SCAU。转化有重组表达质粒 p L ep-SCAU的大肠杆菌 BL 2 1(DE3)在 L B培养基中培养后 ,经 IPTG诱导表达出相对分子质量为 2 0 10 0的鸡 L eptin融合蛋白和少量 4 0 2 0 0的 L eptin融合蛋白。L eptin融合蛋白的表达在 IPTG浓度为 0 .0 5 mmol/ L 时达到最高 ,占总菌体蛋白的 32 .6 %。用 Ni- NTA凝胶从 7L 发酵培养菌裂解液中纯化出 180 m

人骨保护素成熟肽表达载体的构建、表达及重组蛋白免疫学鉴定

目的 :构建人骨保护素 (OPG)成熟肽cDNA重组表达载体 ,实现其在毕赤酵母中的高效表达。方法 :由人成骨细胞提取总RNA ,经RT -PCR扩增得到人OPG成熟肽cDNA ,克隆入分泌型表达载体 pPIC9K ,转化酵母细胞 ,G418筛选多拷贝整合的重组子进行甲醇诱导表达 ,产物行Westernblotting 鉴定。结果 :成功构建了人OPG成熟肽表达载体 ,该载体能在酵母细胞中获得分泌表达 ,诱导96h的表达量占上清总蛋白的30 %。重组蛋白相对分子质量约55ku ,可被OPG抗体识别。结论 :重组人OPG成熟肽在酵母表达系统获得较高水平表达 ,为进一步研究开发基因工程药物准备了条件。

重组人骨形成蛋白成熟肽4对急性放射损伤小鼠造血系统的修复作用

目的探讨重组人骨形成蛋白成熟肽-4(rhBMP-4m)对^(60)Coγ射线照射引起的小鼠造血系统损伤的修复作用。方法 90只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组和rhBMP-4m治疗组,每组30只。模型组和rhBMP-4m治疗组小鼠接受^(60)Coγ射线照射,照射剂量7 Gy,全身照射200 s;正常对照组小鼠不接受照射。模型组小鼠每日腹腔注射生理盐水1.0 mL,rhBMP-4m治疗组小鼠每日腹腔注射rhBMP-4m 0.5 mg,连续治疗6 d。分别于照射后第1、3、5、7、9天检测小鼠外周血白细胞数、骨髓单个核细胞数、骨髓单个核细胞中CD34^+细胞比例;照射后第9天进行脾结节计数,并计算脾脏质量与体质量的比值(脾体比)。结果照射后第1天3组小鼠外周血白细胞计数比较差异均无统计学意义(P>0.05);照射后第3、5、7、9天模型组小鼠外周血白细胞计数低于正常对照组(P<0.01);照射后第3、5天rhBMP-4m治疗组小鼠外周血白细胞计数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),照射后第7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠外周血白细胞计数高于模型组(P<0.05)。模型组小鼠照射后各时间点骨髓单个核细胞计数均低于正常对照组(P<0.01)。照射后第1、3天rhBMP-4m治疗组小鼠骨髓单个核细胞计数与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05),照射后第5、7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠骨髓单个核细胞计数高于模型组(P<0.05)。模型组小鼠照射后各时间点的单个核细胞中CD34^+细胞百分率均低于正常对照组(P<0.01)。rhBMP-4m治疗组小鼠照射后第1、3天单个核细胞中CD34^+细胞百分率与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05),照射后第5、7、9天rhBMP-4m治疗组小鼠单个核细胞中CD34^+细胞的百分率高于模型组(P<0.05)。照射后第9天,模型组小鼠脾结节计数高于正常对照组,脾体比低于正常对照组(P<0.05);rhBMP-4m治疗组小鼠脾结节计数和脾体比高于模型组(P<0.01)。结论辐射可引起小鼠骨髓造血系统损伤,rhBMP-4m能够促进骨髓造血系统的重建。

基因重组人骨形成蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的大规模发酵表达及纯化

含有编码人骨形成蛋白4成熟肽(Bone morphogenetic protein 4 mature peptide,hBMP-4m)cDNA表达质粒的菌株,经50代传代,质粒不丢失,仍然稳定高表达hBMP-4m。将此菌株导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵、诱导表达,测定发酵菌液OD600值为43.5,离心收集菌体,PAGE电泳结果hBMP-4m占细菌总蛋白量的39％。悬浮所收集的菌体、裂菌,洗涤后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的85％。将少量包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解分别上SP阳离子和Q阴离子交换柱,用连续盐浓度的洗脱液洗脱蛋白,收集各蛋白峰做蛋白电泳分析,找到洗脱液的最合适盐浓度。然后将全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上阳离子交换柱SP柱,以最佳盐浓度洗脱液洗脱,获得纯度为91％的hBMP-4m。再上阴离子交换柱Q柱,最佳盐浓度洗脱液洗脱后,所得hBMP-4m纯度为98％。

重组人骨形成蛋白成熟肽-2对辐射小鼠骨髓造血损伤的修复作用

目的:探讨重组人骨形成蛋白成熟肽-2(recombinanthumanbonemor-phogeneticprotein-2mrhBMP-2m)对辐射引起的小鼠骨髓造血损伤的修复作用。方法:通过60Coγ射线照射小鼠,建立骨髓造血损伤动物模型;经rhBMP-2m连续治疗后,比较照射对照组和rhBMP-2m治疗组之间,骨髓单个核细胞数和蛋白含量的差异;同时,通过酶联免疫吸附试验(ELISA),检测骨髓细胞中CD34分子表达水平的变化。结果:经rhBMP-2m治疗后的动物,其单个核细胞数、蛋白含量和CD34分子的表达水平明显高于照射对照组(P<0.05,n=5)。结论:辐射引起的小鼠骨髓造血损伤,rhBMP-2m能够增加造血细胞数量,促进骨髓细胞CD34分子表达,加速造血损伤的修复过程。

中国黄牛PrP^c成熟蛋白基因的克隆和序列分析

根据已发表的牛PrPc蛋白基因序列 ,设计合成一对引物 ,并在2个引物的两端分别加入BamHI和NdeI酶切位点。以从中国黄牛肝脏中提取的基因组DNA为模板 ,经PCR扩增出一约640bp的目的基因片段 ,将此基因克隆于 pET11a载体 ,构建了PrPc蛋白基因重组质粒b-pET11a -PrPc ,转化DH -5α并进行序列测定。同源性分析表明 :中国黄牛PrPc成熟蛋白基因与目前国外发表牛的成熟蛋白PrPc基因相比 ,有较大差异 ,发现了一个新的NdeI酶切位点 ;推导的氨基酸序列有4个氨基酸差异 。

中国黄牛PrP^c成熟蛋白的原核表达和抗原性分析

将中国黄牛PrPc 成熟蛋白基因重组质粒b -pET11a -PrPc(本室构建 )转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。SDS -PAGE电泳显示表达产物的分子量约为23KD ,大小与预计相符 ;免疫印迹 (WesternBlotting)试验进一步证实 ,中国黄牛PrPc 成熟蛋白获得了正确的表达 ,且与大肠杆菌BL21(DE3)

重组人骨形成蛋白成熟肽-4对辐射小鼠骨髓造血损伤的修复作用

目的探讨小鼠受到辐射后,重组人骨形成蛋白成熟肽-4(rhBMP-4m)对辐射引起的骨髓造血损伤的修复作用。方法通过60 Coγ射线照射,建立小鼠骨髓造血损伤模型,经rhBMP-4m连续治疗后,抽血检测小鼠外周血白细胞数,并进行骨髓单个核细胞计数,对脾结节进行计数并通过流式细胞仪检测骨髓单个核细胞中CD34+细胞比例,比较辐射组和实验组之间的差别。结果经rhBMP-4m治疗的小鼠,白细胞数、单个核细胞数、脾结节数和CD34+细胞比例均明显高于辐射组(P<0.05)。结论对于辐射引起的小鼠骨髓造血损伤,rhBMP-4m能够加快骨髓造血系统的重建。

人牙胚釉原蛋白成熟肽基因的克隆

目的:克隆人釉原蛋白成熟肽编码区基因片断,并构建含有该基因的重组表达质粒。方法:从引产胎儿牙胚组织中抽提总RNA,以Oligo(dt)为引物,逆转录合成牙胚cDNA利用PCR,从cDNA中扩增出人釉原蛋白成熟肽编码序列(约540bp),所得目的基因片断插入表达载体质粒PQE30,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,抽提重组质粒DNA,通过PCR、酶切和核苷酸序列分析,鉴定阳性克隆。结果:样品质粒测序证实,质粒PQE30中插入的基因片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全相同。结论:从人胚胎的牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列,成功构建含有人釉原蛋白成熟肽基因的重组表达质粒。

人β2微球蛋白成熟肽基因克隆及其原核表达载体的构建

根据GenBank基因库中人β2微球蛋白(β2m)成熟肽基因序列设计2对引物,使用RT-PCR法从健康人血液中扩增人β2m成熟肽基因,扩增产物进行T-A克隆和测序.结果表明,获得的人β2m成熟肽基因为297 bp,与模板序列的同源性为100%.利用基因重组技术,将β2m成熟肽基因亚克隆入pET-28 a(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET-28/Humβ2m中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET-28/Humβ2m.

重组人骨形成蛋白-4的大规模制备

含有能够高表达重组人骨形成蛋白成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein 4 mature peptide,rhBMP- 4m)质粒的工程菌株,导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,测定发酵菌液OD600值为30．8。离心收集菌体, PAGE电泳后光密度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的42％。悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的83．2％。预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上SP-Sepharose FF阳离子柱,以0.35 mol NaCl洗脱,获得纯度为96％的hBMP-4m。其收获量为1．34g/L发酵液;收得率为36．4％。结果表明:使用这套工艺流程大规模制备hBMP-4m,能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度。

大肠杆菌表达的重组人BMP-2和hBMP-4成熟肽大规模制备方法的比较

目的:大规模制备人骨形成蛋白成熟肽(hBMP-m):hBMP-4m和hBMP-2m.方法:两种工程菌株分别含有能够高表达hBMP-4m和hBMP-2m的质粒,分别导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达,离心收集菌体,悬浮所收集的菌体,裂菌,洗涤4次.预先取少量样品进行探索实验后,全部包涵体分别用8 mol/L尿素缓冲液溶解,上Sepharose SP-FF阳离子柱.结果:发酵菌液A600 nm值分别为28.8和26.3.SOS-PAGE电泳后吸光度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的40.0%,hBMP-2m占细菌总蛋白量的47.2%.洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的82.9%,hBMP-2m占蛋白量的84.5%.上Sepharose SP-FF阳离子柱后,分别收集0.35 mol/L NaC l和0.20 mol/L NaC l洗脱部分,获得纯度为96%的hBMP-4m及纯度为95%的hBMP-2m.其收获量分别为1.30 g/L发酵液和1.25 g/L发酵液;收得率分别为34.33%和34.81%.结论:大规模制备hBMP-4m和hBMP-2m时,使用相同的发酵程序及相近的纯化方法,都能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度.

重组人骨形态发生蛋白-2原核表达及单克隆抗体制备

目的利用原核表达系统(E.coli)表达纯化重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m),并制备rh-BMP-2m的单克隆抗体。方法将工程菌株进行常规发酵,自诱导表达,裂菌离心分离包涵体,包涵体变性后经阳离子交换色谱分离纯化。纯化后的变性rhBMP-2m经稀释复性,获得具有生物学活性的rhBMP-2m。并以此作为抗原,免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。结果获得还原SDS-PAGE下95%以上纯度的rhBMP-2m。细胞活性结果分析显示,所获得的rhBMP-2m具有较强的生物学活性。免疫小鼠最终获得两株稳定分泌抗rhBMP-2m抗体的杂交瘤细胞株。结论成功制备了具有生物学活性的rhBMP-2m及其单克隆抗体,为rhBMP-2未来的研究和制备奠定良好的基础。

鸡白细胞介素18成熟蛋白的原核表达及抗体间接ELISA方法的建立

将鸡白细胞介素18的成熟蛋白（chickeninterleukin18matureprotein，mChIL-18）基因在原核系统表达，采用Ni～NTA亲和层析方法纯化得到该重组蛋白。纯化后重组蛋白包被反应板，通过方阵滴定确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、羊抗鼠酶标二抗稀释倍数，

釉成熟蛋白真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的:构建釉成熟蛋白真核表达载体pcDNA3.1-Amelotin,并观察其在293T细胞中的表达情况。方法:以出生后6 d的昆明小鼠下颌磨牙中提取的总RNA为模板,设计合成特异性引物,通过RT-PCR法扩增小鼠的釉成熟蛋白[Amelotin(GeneID:71421)],包括编码区全长在内的部分cDNA序列,克隆到pMD18-T克隆载体,酶切鉴定正确;然后亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体中,双酶切鉴定及测序正确。将构建的重组载体磷酸钙法转染293T细胞,检测Amelotin的表达情况。结果:成功克隆了Amelotin基因编码区全长序列;构建出重组真核表达载体pcDNA3.1-Amelotin,磷酸钙法转染后可检测到Amelotin基因在293T细胞中的表达。结论:构建了重组pcDNA3.1-Amelotin真核表达载体,并成功表达,为进一步研究该蛋白的生物学活性奠定了基础。

豌豆中控制产量、籽粒蛋白质含量和成熟期的QTL的鉴定

育种实践证明改良豌豆籽粒产量、种子蛋白质含量和成熟期是相当困难的。应用分子标记有助于了解控制这些性状的遗传因子和选育优良基因型。本研究旨在鉴定与籽粒产量、种子蛋白含量和早熟性相关的遗传位点。试验材料为源于‘Carneval’בMP1401’组合的88个重组自交系，试验时间为1998、1999和2000年，在加拿大的Alberta、Marnitoba和Saskatchewan3个省的13种环境评价了88个材料。

原核表达牦牛朊蛋白的纯化及其活性测定

以原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白为抗原,免疫BALB/C小鼠,制备抗牦牛朊蛋白的特异性抗血清。经Western blotting和间接ELISA鉴定,该抗血清可与牦牛重组成熟PrP(23～242)和牛脑组织提取物发生反应,蛋白酶K消化各抗原可消除免疫反应,但不与GST蛋白和E.coli BL21(DE3)的菌体蛋白发生反应,表明该抗血清为抗牦牛重组成熟PrP(23～242)的抗血清,其效价高达1∶12800,并能识别黄牛脑组织中的天然朊蛋白。原核表达的GST-BoPrP(23～242)融合蛋白能有效地刺激免疫动物产生PrP特异性抗体,所制备的抗血清可适用于天然朊蛋白的检测。

人骨形态发生蛋白2(BMP-2)在巴斯德毕赤酵母中的表达

以重组质粒pUC-BMP2为模板PCR扩增人BMP-2成熟肽编码序列,将该序列克隆入pGEM-T载体进行DNA序列分析后亚克隆入分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9K中。重组质粒oPIC9K-BMP2经BelⅡ酶切后回收线性化片段,聚乙二醇法转染毕赤酵母茵株GS115。PCR筛选整合有人BMP-2基因的酵母细胞重组子,以甲醇进行诱导表达,于酵母细胞培养基中可检测到rhBMP-2。体外培养条件下,所得rhBMP-2可增加2T3小鼠成骨细胞内碱性磷酸酶活性;体内实验.rhBMP-2冻干粉可于小鼠骨四头肌肌袋中诱导软骨细胞群产生。