重组SEA基因真核表达载体的构建及诱导小鼠抗肝癌免疫的效应

目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)真核表达载体 ,并通过体内转染 ,观察其诱导抗小鼠肝癌的免疫效应。方法采用基因工程技术构建SEA基因的真核表达载体 ,使其表达SEA分子。通过阳离子脂质体介导的体内转染 ,观察其对小鼠肝癌的治疗作用。用51 Cr释放法测定治疗组与对照组动物脾淋巴细胞杀伤H2 2 细胞的活性。结果成功地构建了SEA真核表达载体 pLXSN SEA ,体内转染 pLXSN SEA的荷瘤小鼠肿瘤明显缩小 ,生存期延长 ,4 10小鼠肿瘤完全消退 ,且长期无瘤生存。CTL杀伤活性实验表明 ,瘤区内转染pLXSN SEA可诱导强烈的CTL杀伤效应 ,与对照组相比较差异显著 (P <0 .0 1)。结论超抗原SEA体内转染对肿瘤具有明确的治疗作用 。

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因重组真核表达载体的构建

将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV) HB株的核蛋白基因亚克隆到表达载体 pc DNA3的Kpn 酶切位点 ,快速筛选鉴定出含有 HB核蛋白基因的重组质粒 ,经酶切、PCR及 Southern鉴定为正向插入了 HB核蛋白基因 ,将其命名为 pc DNA-N。对重组质粒进行大量扩增 ,应用聚乙二醇纯化后 ,对 SPF雏鸡进行了免疫攻毒试验 ,结果表明 ,IBV核蛋白在抗感染和抗致死方面具有一定的作用。

含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建

目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础。

人自噬基因hAPG_(12)的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的:探讨克隆人自噬基因h APG12 ,构建重组真核表达载体p EGFP- C2 -h APG12 ,为进一步研究h APG12 的功能奠定基础。方法:从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,采用两步法RT- PCR,首先把RNA逆转录为c DNA,而后通过一对h APG12 的特异性引物扩增出目的基因,PCR产物与测序载体p UC18连接后转化到大肠杆菌DH5 α,而后对单菌落进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。将测序正确的h APG12 亚克隆入真核表达载体p EGFP-C2 ,该重组载体转化到大肠杆菌DH5 α后进行菌落PCR和酶切鉴定。结果:测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的h APG12 c DNAs含有2 2 5个碱基,与Genbank( BC0 1 1 0 33)序列完全一致。构建的重组真核表达载体经鉴定证实h APG12 基因已完全正确亚克隆到p EGFP- C2 。结论:成功克隆了人自噬基因h APG12 并构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白( EGFP)基因的重组真核表达载体p EGFP- C2 - h APG12 ,为以后研究h APG12

1型人类免疫缺陷病毒tat基因重组分泌型真核表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因分泌型真核表达载体。方法聚合酶链反应(PCR)法从缺失pol基因的重组HIV-1基因组pNL4-3中扩增tat基因;将PCR获得的tat基因片段和pSecTag2B分泌型真核表达载体分别用Hind III酶切;pSecTag2B载体片段经小牛碱性磷酸酶去磷酸化后,用T4 DNA连接酶将tat基因与pSecTag2B载体片段连接过夜并转化感受态大肠杆菌DH5α,提取阳性克隆质粒进行Hind III酶切鉴定,并利用Nco I酶切鉴定克隆的tat基因反向。最后选取正向tat基因克隆质粒送基因测序。结果 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上约320bp位置出现条带,与预期的324bp大小一致;经Hind III和Nco I分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的tat基因序列与Genbank中登记的HIV-1 tat基因100%同源。结论本研究方法可以成功地构建HIV-1 tat基因分泌型真核表达载体。

重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究

目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 10转染的抑瘤效果 ;采用细胞培养技术 ,观察小鼠体内注射化疗药物后 ,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响 ;采用细胞计数的方法 ,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学 ;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH5 10转染 ,观察抑瘤效果。结果 :转染pCH5 10对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用 ,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低 ,活化受阻 ,在化疗后第 3天免疫细胞数降至最低 ,约 10d左右恢复正常 ;化疗后立即连续 10d转染 pCH5 10质粒 ,疗效没有增强 ;化疗 5d后 ,再连续 15d转染 pCH5 10质粒 ,则疗效明显增强。 结论 :化疗后转染 pCH5 10质粒 ,对小鼠肿瘤治疗效果更好 ,但由于化疗既降低免疫细胞数量 ,又抑制其功能 ,化疗后立即转染pCH5 10质粒是不恰当的 ,并且转染治疗时间不宜过短。pCH5 10、化疗和化疗 +pCH5 10三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性 ,既抑瘤又促瘤。

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。

鼠肌肉转录调节因子MyoD基因真核表达载体的构建

目的 构建肌肉转录调节因子 Myo D基因真核表达载体 ,为深入研究 Myo D在肌肉修复中的分子调节机制 ,探讨其在肌肉损伤方面的生物学行为 ,为临床应用提供物质基础。方法 含 Myo D c DNA的质粒PEMMBC2 β5于大肠杆菌 E.Coli DH5 a内扩增 ;提取及纯化 PEMMBC2 β5质粒 ;经 DNA序列分析含 Myo Dc DNA;限制性酶切 Myo D c DNA片段 ,连接酶连接到真核表达质粒 pc DNA3- neo内 ,克隆出真核表达载体pc DNA3/ Myo D。结果 提取及纯化的 PEMMBC2 β5质粒含有大小正确的 Myo D c DNA碱基片段 ,其碱基序列为编码目的基因的正确序列 ,凝胶电泳结果证明已将此片段正确地克隆到 pc DNA3/ Myo D内。结论 成功的构建了Myo D基因的真核表达质粒 pc DNA3/ Myo D。

单羧酸转运泵基因反义真核表达载体的构建

目的 构建单羧酸转运泵基因反义逆转录病毒真核表达载体。方法 应用RT PCR方法扩增带有双酶切位点的单羧酸转运泵目的基因片段 ,与带有相同酶切位点的pLXSN逆转录病毒真核表达载体粘末端进行反向基因插入连接 ,构建具有反义表达的逆转录病毒载体。结果 构建载体进行双酶切电泳分析及插入片段基因序列分析 ,证明反义载体构建成功。结论 应用RT PCR方法扩增插入DNA片段 ,简单、灵活、快捷。双酶切定向连接构建反义表达载体可实现构建一步到位 ,免去正反向筛选的麻烦。

鼠骨骺增殖区细胞的分离鉴定和克隆构建PTHrp基因真核表达载体

[目的]分离、鉴定大鼠骨骺生长板增殖区软骨细胞,克隆甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrp)基因并构建真核表达载体pEGFP-IRES2-PTHrp。[方法]Percoll不连续密度梯度离心法分离生长板增殖区软骨细胞,用X型胶原抗体和电镜鉴定,提取总RNA,RT-PCR方法获得PTHrp基因的全长cDNA,插入pCR2·1TA克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRES2。[结果]分离出增殖区软骨细胞,经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。[结论]准确分离增殖区软骨细胞并成功构建了PTHrp基因的真核表达载体,为进一步揭示PTHrp的生物学功能及其在在软骨细胞的分化和骨骼形态发生中的作用奠定了基础。

人釉原蛋白编码区基因真核表达载体PsecTaq2A-AMG的构建

目的 构建人釉原蛋白 (AMG)编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。方法 采用PCR技术体外扩增AMG完整分泌肽编码区。将扩增产物与PsecTaq2A分别用BamHI和XholI行双酶切 ,将获取的AMG目的基因片段连接到双酶切后的PsecTaq2A ,构建重组质粒PsecTaq2A_AMG ,并对重组质粒进行鉴定。结果 ①PCR扩增产物经 1 5 %琼脂糖凝胶电泳 ,可见大小约 5 19bp的特异性条带 ,与预期结果一致。②重组克隆PsecTaq2A_AMG酶谱分析与预期结果一致 ,序列测定结果与GenBank中的人釉原蛋白序列完全一致。结论 用此方法可成功构建AMG编码区基因真核表达载体PsecTaq2A_AMG。

大鼠肌细胞生成素基因真核表达载体的构建

目的 构建骨骼肌肌细胞生成素 (myogenin)基因真核表达载体 ,深入探讨在骨骼肌损伤及骨骼肌失神经萎缩的发生、发展过程中的变化规律 ,以及病理过程。 方法 含 myogenin c DNA的克隆载体 p GEMT- myogenin经限制性内切酶 Hind 和 Xho 双酶切 ,得到含这两个酶切位点之 myogenin c DNA片段 ,T4 连接酶连接到含有这两个酶切位点的真核表达载体 pc DNA3,构建出重组真核表达载体 pc DNA3- myogenin,经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定及 DNA测序证实 c DNA片段大小和序列的正确性。 结果 经凝胶电泳鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定证实 :pc DNA3-myogenin含大小正确的 myogenin c DNA片段 ,DNA测序证实其 DNA序列正确。 结论 成功地构建了肌细胞生成素基因真核表达载体 pc DNA3-

构建不同筛选特性的HBV X基因真核表达载体

目的:构建不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体。方法:从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因,利用pCEP4和pcDNA3.1(+)两者多克隆位点的特点,选用pGEMR○-T Easy Vector构建中间载体pEasy-X,分别酶切后连接特异性片段构建载体pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X。结果:从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy-X,酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X构建成功。结论:具有不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体业已成功构建。

hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达

目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。

pcDNA3.1(+)/人前脑啡肽原基因真核表达载体的构建

目前慢性疼痛及癌症晚期疼痛的治疗方法仍主要依靠三阶梯药物疗法,三阶梯药物中以外源性镇痛药吗啡为主,其不良反应大,成瘾性高,限制了其大量使用,因此研究新的镇痛药及新的镇痛方法成为最近研究的热点。20世纪50年代以来,人们着力于研究新的镇痛物质,之后内源性镇痛物质[1]的发现及基因克隆技术[2]的应用为开辟新的镇痛研究奠定了基础。

重组人内皮抑素真核表达载体pCD-sEndo的构建和表达

目的:构建表达人内皮抑素的重组真核表达载体,并将其转染人肝癌SMMC-7721细胞,观察其体外抑制血管生成的活性. 方法:将含有IL-2分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pcDNA3.0产生重组质粒pCD—sEndo,利用阳离子脂质体介导将其体外转染人肝癌细胞SMMC- 7721细胞.G418筛选后得到阳性克隆,并被命名为SMMC/sEndo,采用Western—blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验检测转染细胞上清中内皮抑素蛋白的生物活性. 结果:成功构建endostatin基因的真核表达质粒pCD—sEndo并经酶切和序列测定证实,通过阳离子脂质体转染SMMC-7721细胞,Western-blot显示转染细胞上清有人endostatin蛋白的表达,Mr 20 000,而转然空质粒对照组未检测到目的蛋白.CAM实验显示在给予内皮抑素蛋白的鸡胚绒毛膜血管稀疏,血管密度明显减少,并且随着蛋白量的增加,血管减少程度加强. 结论:重组endostatin真核表达质粒构建正确,转染SMMC-7721细胞后可有效表达具有生物学活性的人endostatin蛋白并能分泌到细胞外.

人SCL基因pDC315-EGFP真核表达载体的构建及意义

目的构建含有人SCL基因的pDC315-EGFP真核表达载体,为糖尿病膀胱病变(DCP)的治疗提供新思路。方法从含有人SCL基因的质粒中,采用PCR方法扩增SCL基因,将目的载体pDC315-EGFP进行酶切后交换,其产物转化细菌感受态细胞,对克隆产物进行菌落PCR鉴定,对阳性克隆产物进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的质粒。结果 PCR扩增的基因片段长度为1 036 bp,测序结果以及重组质粒pDC315-EGFP-SCL阳性克隆凝胶电泳鉴定均证明SCL基因成功克隆到真核表达载体中。结论成功构建了真核表达载体pDC315-EGFP-SCL,该载体有望用于DCP的治疗。

野生型抑癌基因PTEN真核表达载体的鉴定及其在COS-7细胞株表达产物的鉴定

目的:电泳并真核细胞鉴定pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒。方法:将含有pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒的EcoliJM109细胞挑少许于LB液体培养基上,振荡过夜,离心,碱裂解法裂解细菌,参照UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒操作步骤抽提质粒,电泳鉴定,将获得的pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒采用脂质体转染法转入COS-7细胞株,传代培养细胞株,West-Blot鉴定PTEN蛋白质的表达。结果:实验得到的pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒大小约为6.0kb,质粒浓度为0.080μg/μl。该质粒目的基因在COS-7细胞株表达产物经West-Blot鉴定证实为目的基因表达产物。结论:pcDNA3.0-PTEN真核表达质粒内含有所需目的基因,该真核表达系统能在真核细胞株COS-7表达所需目的基因产物,可以应用该质粒对PTEN基因缺失或杂合性缺失的肿瘤细胞进行试验性治疗。

抗阿尔茨海默病重组真核表达载体的构建

目的 :将淀粉样蛋白 N端的抗原表位基因以 4种不同的组合与小鼠 Ig G重链区基因融合 ,构建抗阿尔茨海默病的重组质粒。方法 :通过 RT- PCR技术从小鼠脾组织中克隆 Ig G重链区 c DNA,将柔性接头与抗原表位基因序列设计在 5′端引物中 ,然后以克隆出的小鼠 Ig G重链区 c DNA为模板 ,用 PCR法克隆出由柔性接头将抗原表位和 Ig G重链区基因融合在一起的序列 ,并插入到 p VAX质粒载体中。结果 :扩增出来的 4种不同组合的抗原表位基因和 Ig G重链区基因融合序列大小分别为 999、1 0 2 0、1 0 0 5、1 0 2 6 bp,均与 Gen Bank上登录的相符 ;p VAX重组质粒酶切结果表明融合基因正确地插入到 p VAX载体中 ,全自动测序亦显示抗原表位基因和 Ig G重链区基因为所需基因 ,接头序列也完全正确。结论 :成功构建了抗阿尔茨海默病的 4种表位基因 - Ig G重链区融合表达的重组质粒 。

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2。方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR-XL-TO-PO载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达。结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确。重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录。重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达。Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达。结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础。