表达鸡传染性贫血病毒VP1蛋白的新型重组血清4型禽腺病毒的构建

为研制新型鸡传染性贫血(CIA)高效疫苗以解决国内商品鸡群中普遍存在的鸡传染性贫血病毒(CIAV)感染问题,试验利用CRISPR-Cas9技术和Cre-LoxP系统,以血清4型禽腺病毒(FAdV-4)为载体,构建表达CIAV VP1蛋白的重组FAdV-4。通过间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹试验对重组病毒进行验证,通过体外病毒生长曲线来研究其复制效率。结果显示:该重组病毒构建成功,能有效表达CIAV VP1蛋白,命名为rFAdV-4-CIAV-VP1,且发现rFAdV-4-CIAV-VP1在LMH细胞中的复制效率远低于野生型FAdV-4。研究表明构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1为CIAV和FAdV-4的联防联控提供了二联候选疫苗株。

肥大细胞对重组口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式识别效应

为研究肥大细胞对重组口蹄疫病毒VP1-VP4蛋白的模式识别作用,将VP1-VP4蛋白负载经TLR2/TLR4抑制剂、甘露糖受体抑制剂或清道夫受体抑制剂预处理的小鼠肥大细胞系P815,在不同时间点观察其脱颗粒现象,并用ELISA检测细胞上清液中TNF-α的含量。结果显示,清道夫受体抑制剂处理组在负载VP1-VP4蛋白15和30min时P815细胞脱颗粒数目均极显著低于重组VP1-VP4蛋白组(P<0.001)。在负载VP1-VP4蛋白24h时,各抑制剂处理组的TNF-α含量均极显著低于VP1-VP4蛋白组(P<0.001),其中以甘露糖受体抑制剂处理组含量最低。这表明小鼠肥大细胞系P815主要通过清道夫受体识别FMDV VP1-VP4并引起脱颗粒现象的发生,而甘露糖受体和TLR2/TLR4识别FMDV VP1-VP4则是引起P815细胞分泌TNF-α的主要模式识别机制,其中以甘露糖受体的作用最强。

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原,与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构,所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗,用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫,以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础,在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因,经双酶切及测序鉴定,成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞,拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示,该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明,重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性,插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。

血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达及多克隆抗体制备

目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1基因截短蛋白多克隆抗体,为FAdV-4病的诊断、检测及致病机制研究奠定基础。方法:对FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株Fiber-1基因序列(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析,截取具有较高免疫原性的片段,设计合成特异性引物,以CH/AHMC/2015分离株基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得截短Fiber-1(sFiber-1)基因片段,将其连接至原核表达载体pET-32a,验证后转化至大肠杆菌BL21感受态中,诱导表达sFiber-1蛋白。纯化后的蛋白与佐剂乳化后免疫SD大鼠,制备多克隆抗体,并测定多克隆抗体效价。用Western-blot检测抗体免疫原性。结果:成功构建了sFiber-1的原核表达载体,获得FAdV-4的sFiber-1重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定,重组sFiber-1蛋白大小约为52 kDa,主要以包涵体形式表达;间接ELISA法测得sFiber-1多克隆抗体效价为1∶2^(13);Western blot结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别出重组sFiber-1蛋白。结论:本研究成功表达了FAdV-4的重组sFiber-1蛋白,制备了具有较高免疫活性的sFiber-1多克隆抗体,可为FAdV-4的检测及诊断奠定基础。

重组杆状病毒表达轮状病毒SA11毒株VP4蛋白

从培养的SA11病毒中提取病毒dsRNA作为模板，经逆转录、多聚酶链反应（RT-PCR）获得编码VP4蛋白的全基因，全长2362bp.完整的VP4基因克隆到杆状病毒转移载体pVL-1393中，转染Sf9细胞进行同源重组，用声、杂交法筛选出表达VP4蛋白的重组杆状病毒。表达的VP4蛋白能被抗轮状病毒抗体所识别，表达产量约占总蛋白的10％。用表达的VP4蛋白免疫动物后可产生高水平抗亲本SA11毒株中和抗体。抗体能阻断SA11病毒在MA104细胞上引起的细胞病变（CPE），免疫荧光和Westernblot也证实抗体可特异性识别轮状病毒抗原。结果表明，重组杆状病毒表达的VP4蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，可望用VP4基因研制轮状病毒重组疫苗和亚单位疫苗。

引起细胞病变的甲肝病毒BJ-1株结构蛋白VP4-VP2基因序列的测定

目的测定我室分离的甲型肝炎病毒(HAV)BJ-1株结构蛋白VP4-VP2基因区的核苷酸序列。方法从BJ-1感染的A549细胞中提取病毒RNA模板,通过RT-PCR扩增相应的cDNA片段,测定其核苷酸序列。结果BJ-1株与野型株MBB比较,VP4-VP2区有4个核苷酸变异,同源性为99.5％(731/735),推论的氨基酸序列有1个氨基酸变异,同源性为99.6％(244/245)。与HM-175比较,有30个核苷酸变异,同源性为95.9％(705/735),推论的氨基酸序列均相同,同源性为100％。结论核苷酸序列分析结果初步确定BJ-1株属甲型肝炎病毒。

柯萨奇病毒A16型VP1-VP4基因克隆及其表达产物的抗原相关性分析

目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1-VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8 mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,用柯萨奇病毒A16型病毒免疫兔血清及肠道病毒71型病毒免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA分析其抗原相关性及交叉反应性。结果成功构建的重组质粒pQE30a/VP1-VP4并经IPTG诱导,重组蛋白VP1-VP4高效表达并纯化成功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1-VP4可以被CVA16免疫兔血清特异识别,部分与肠道病毒71型免疫血清存在交叉反应。结论在大肠杆菌M15中高效表达出柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白,经纯化产物具有较强的抗原反应性。

表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒VP1蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)VP1蛋白的重组腺病毒,本实验采用RT-PCR方法扩增DHV-Ⅰ HP-1株VP1基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,并将其电转化于含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183中,通过同源重组制备含有重组腺病毒的质粒。重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD293细胞,获得重组腺病毒(rAd-VP1)。间接免疫荧光和western blot鉴定结果显示,DHV-Ⅰ的VP1蛋白在重组腺病毒感染的AD293中获得表达。rAd-VP1的制备为鸭免疫实验效果评价奠定了基础。

清道夫受体在树突状细胞提呈口蹄疫病毒VP1-VP4抗原中的作用

为研究清道夫受体在树突状细胞提呈口蹄疫病毒VP-VP4融合蛋白中的作用,构建了pET一32a-VP1-VP4原核表达系统,以此获得VP1-VP4融合蛋白。制备骨髓源树突状细胞(BMDCs)和淋巴结T细胞,首先用清道夫受体抑制剂poly(I)处理.BMDCs,然后再将VPl-VP4.融合蛋白负载经poly(I)处理后的BMDCs,并与淋巴结T细胞共培养,收集不同时间点的共培养上清液,用ELISA检测其中IFN-γ含量。结果显示,经poly(I)处理的试验组在每个时间点产生的IFN-γ含量均明显高于对照组,且差异极显著(P<0.01)。表明清道夫受体可识别口蹄疫病毒VPl-VP4融合蛋白,并在BMDCs提呈VPl-VP4抗原的过程中发挥负调节作用。

表达GⅡ.4型诺如病毒VP1复制缺陷型腺病毒构建与鉴定

人诺如病毒(norovirus,NoV)在体外难以培养,不宜采用经典疫苗的方式进行疫苗研发,以腺病毒为载体的重组腺病毒疫苗为诺如病毒疫苗的研发提供另一种路线选择。构建表达人GⅡ.4型诺如病毒VP1蛋白的重组腺病毒为该技术路线的疫苗研发奠定基础。首先使用PCR扩增诺如病毒VP1片段,通过酶切、连接、转化,克隆含VP1基因的pshuttle-CMV-VP1穿梭质粒,再与腺病毒骨架质粒进行同源重组,重组质粒鉴定正确后使用PacⅠ酶切线性化,转染至HEK293细胞进行病毒包装,包装成复制缺陷型的完整腺病毒颗粒命名为rAd-VP1,病毒传代后进行滴度测定,并感染HEK293细胞,通过Western Blot方法鉴定重组腺病毒外源蛋白VP1的表达情况。结果表明,包装传代后的重组腺病毒浓缩后滴度达到CCID_(50)=5×10^(9)/mL,并且能在HEK293细胞成功表达VP1蛋白。研究为rAd-VP1的动物免疫评价和诺如病毒的疫苗研发提供基础。

重组干扰素α-2b雾化对毛细支气管炎患儿炎症因子及血清MMP-9、TLR4、TGF-β_(1)的影响

目的:探讨重组干扰素α-2b雾化对毛细支气管炎患儿炎症因子及血清基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Toll样受体4(TLR4)、转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))的影响。方法:选取2020年1月—2022年6月在汉川市妇幼保健院诊治的118例毛细支气管炎患儿为研究对象,采用随机数表法将其分为对照组(n=59)和研究组(n=59)。对照组给予常规治疗,研究组在常规治疗的基础上给予重组干扰素α-2b雾化治疗。比较两组治疗前后的炎症因子及血清MMP-9、TLR4、TGF-β_(1)水平。结果:治疗后两组白细胞介素-4(IL-4)、MMP-9、TLR4、TGF-β_(1)水平较治疗前均降低,白细胞介素-10(IL-10)、干扰素γ(IFN-γ)水平较治疗前均升高,研究组IL-4、MMP-9、TLR4、TGF-β_(1)水平均低于对照组,IL-10、IFN-γ水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。研究组的治疗总有效率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:重组干扰素α-2b雾化辅助治疗毛细支气管炎患儿,可有效改善炎症因子,降低血清MMP-9、TLR4、TGF-β_(1),疗效显著。

鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1重组蛋白的免疫保护效果试验

将鸭甲肝病毒鸡胚化弱毒MY株Vp1基因原核表达工程菌(pET32a+Vp1,BL21(DE3)PlysS)对基因Vp1进行大量表达和纯化,得到鸭甲肝弱毒MY株Vp1重组蛋白作为抗原制备亚单位疫苗,免疫雏鸭,用间接ELISA检测方法对免疫后抗体生成水平进行监测,并通过动物攻毒试验评价免疫保护效果。结果显示:Vp1重组蛋白免疫家兔后血清检测琼扩效价≥1∶64,细胞中和试验效价为1/45;雏鸭免疫后抗体生成水平呈明显上升趋势,对攻毒起到了保护作用。首次揭示了DHAV-1结构蛋白Vp1刺激机体产生抗体使雏鸭获得保护的能力。

肠道病毒71VP1重组蛋白的纯化与鉴定

近年来,肠道病毒71引发的手足口病发病率在我国呈上升趋势,严重危害儿童健康.本研究利用已有的重组原核表达载体pET32a-VP1,在大肠杆菌BL21内诱导其表达VP1融合蛋白,使用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE结果表明重组蛋白表达且纯化浓度较高,可用于今后的EV71抗原表位筛选与抗EV71病毒疫苗开发研究.

基于VP1重组蛋白的口蹄疫病毒O型间接ELISA检测技术

采用RT—PCR方法扩增0型口蹄疫病毒VP1基因片段，将其克隆于pET-32a。将重组质粒转化宿主菌Rosetta，经1．Ommol／LIPTG诱导，外源基因获高效表达。通过Western—blot以及ELISA试验证明，重组VP1蛋白与标准阳性血清发生反应。

柯萨奇病毒B4型VP1蛋白的生物信息学分析

目的:分析柯萨奇病毒B4型(coxsackievirus B4,CVB4)的结构蛋白VP1的分子结构,预测其生物学信息。方法:应用Bioedit、DNAstar、ABCpred软件,以及免疫表位数据库网站IEDB和生物信息学门户ExPASy提供的多种在线工具,对CVB4 VP1蛋白的氨基酸序列进行分析。结果:CVB4 VP1蛋白的等电点8.31,相对分子量32.1 kD,为亲水性、不稳定蛋白质;有36个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜螺旋结构,二级结构以无规则卷曲为主;预测有5条优势线性B细胞表位。结论:通过对CVB4 VP1蛋白的生物信息学分析,得到了VP1蛋白的理化性质,相关结构的功能特征及线性B细胞表位等生物信息资料。

口蹄疫病毒VP1蛋白在酵母中的表达及免疫原性分析

目的 :利用毕赤酵母表达系统表达牛O型口蹄疫外壳蛋白(FMDVVP1) ,并对表达的蛋白进行免疫原性鉴定。方法 :将FMDVvp1基因克隆到毕赤酵母Pichiapastoris分泌性表达载体pSuperY中 ,构建重组表达载体pSuperY/vp1,经测序证明vp1基因序列的正确性。将纯化的重组质粒经线性化酶切后 ,用电转化法将pSuperY/vp1导入毕赤酵母菌种SMD116 8H中。对表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行分析 ,并用酵母表达的FMDVVP1蛋白免疫小鼠。结果 :以重组质粒pSuperY/vp1转化毕赤酵母菌后 ,能表达相对分子量 (Mr)为 6 6 0 0 0和4 30 0 0的FMDVVP1蛋白。动物免疫结果表明 ,FMDVVP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。结论 :在毕赤酵母中成功地表达FMDVVP1蛋白 。

炎症因子和TOLL样受体4重组蛋白及内皮缩血管肽-1在冠状动脉性心脏病患者中的表达与经皮冠状动脉介入治疗术后支架内再狭窄的相关性分析

目的探讨炎症因子、TOLL样受体4重组蛋白(TLR4)及内皮缩血管肽-1(ET-1)在冠状动脉性心脏病患者中的表达与经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后支架内再狭窄的相关性。方法回顾性分析2019年5月至2020年5月于本院行PCI术的48例冠状动脉性心脏病患者的临床资料,根据术后是否出现支架内再狭窄(ISR)分为ISR组(n=20)和非ISR组(n=28),比较两组血清白细胞介素-18(IL-18)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、ET-1及TLR4表达水平,采用多元logistic线性回归分析上述指标在冠状动脉性心脏病患者中的表达与PCI术后支架内再狭窄的相关性。结果治疗6个月后,非ISR组血清IL-18、hs-CRP、ET-1及TLR4表达水平均低于ISR组,差异有统计学意义(P<0.05);多元Logistic线性回归分析结果显示,hs-CRP、TLR4均为ISR的独立影响因素(P<0.05)。结论PCI术后联合检测hs-CRP、TLR4水平对冠状动脉性心脏病患者PCI术后发生ISR具有一定的预测价值。

AsiaⅠ口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果:成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株,分别命名为:1B8、5E1、5E2,其分泌的mAb为IgG1(1B8)和IgG2a(5E1、5E2)亚类,他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒,其腹水效价在1:105～1:106。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV,中和效价达1:1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性,型间无交叉反应,证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论:在口蹄疫病毒mAb的研究中,VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1mAb的成功制备,为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。

重组人TGF-β1融合蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的构建人转化生长因子-β1(TGF-β1)基因的原核表达载体,表达并纯化GST-hTGFβ1.方法应用RT-PCR获得人TGF-β1的基因片段,成功构建人TGF-β1原核表达载体,诱导表达人TGF-β1与GST的融合蛋白;应用亲和层析法纯化重组融合蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blot检测分析.结果成功构建了人TGF-β1重组融合表达质粒pGEX-4T-1-TGF-β1,表达的蛋白经SDS-PAGE电泳分析,在Mr约为39×103处出现了一条新生的蛋白条带,该表达蛋白具有与TGF-β1抗体特异性的结合能力.结论成功构建了人TGF-β1基因的原核表达载体并纯化了该基因的原核表达产物,为下一步的人TGF-β1自体疫苗的研制奠定了基础.

重组胸腺素β4调节ICAM-1、MMP-2和LN-5促进创伤愈合的实验研究

目的探讨重组胸腺素β4(Thymosin β4,Tβ4)通过改善创面基质环境促进大鼠皮肤创伤愈合的作用机制。方法在大鼠背部制作直径8mm的全层皮肤损伤模型,动物分为对照组(PBS)、Tβ4低剂量组、Tβ4中剂量组、Tβ4高剂量组,每组5只,每天两次给药,2d、4d、7d取材,行ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1)、MMP-2(Matrix metallopoproteinase-2)、LN-5(Laminin-5)的免疫组化并进行平均积分光密度(IOD)分析。结果经Tβ4处理后的创面,ICAM-1阳性表达多,早期中、高剂量组表达较强(p<0.01),中期均减弱,高剂量组相对较强;晚期各组表达增强,高剂量组最强(p<0.01)。MMP-2早期对照组表达最高(p<0.01),高剂量组最弱(p<0.01);中期中剂量组表达明显(p<0.05);晚期基质阳性明显增多,对照组表达最强(p<0.01),高剂量组最弱(p<0.01)。LN-5早期各组均可见较多的阳性表达,对照组与低剂量阳性强(p<0.01),中剂量组阳性最少;中期中剂量组表达最强(p<0.01);晚期中剂量组仍然有较强的阳性表达(p<0.01)。结论Tβ4可能是通过调节ICAM-1、MMP-2、LN-5的表达,改善创面基质环境,促进皮肤创伤愈合。