重组cDNA表达文库血清学分析技术筛选肿瘤抗原的研究进展

1995年Sahin等首先建立了重组cDNA表达文库血清学分析法 (SEREX)以来 ,大量的人类肿瘤抗原被发现和鉴定 ,并建立了SEREX技术合作组及相应的数据库。

采用SEREX方法从cDNA表达文库中筛选大肠癌抗原基因

目的寻找人源性大肠癌特异性抗原基因。方法采用SMART技术构建人大肠癌组织来源的cDNA噬菌体表达文库,以自体或异体大肠癌患者血清按SEREX方法进行免疫筛选,对平板法扩增获得的阳性克隆片段导入克隆载体PUCm-T后进行测序、鉴定和BLAST同源性比较,并根据cDNA序列进行生物信息分析。结果构建了3个大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库,其滴度分别为2.39×10^6pfu/mL、2.07×10^6pfu/mL和1.86×10^6pfu/mL,插入片段长度为0.5-4 kb,平均分别为1.4、1.6和1.3 kb,重组率最高达到97.5%。选择高滴度文库扩增后滴度达到4.1×10^10pfu/mL。SEREX筛选共获得16个阳性克隆,代表12个不同抗原基因,其中10个基因片段为已知抗原基因,如IFITM1、CD24、Survivin、KLK6等,2个为未知EST片段。根据序列分析,筛选出的抗原基因有结构基因、调节基因、代谢相关基因等。结论利用SEREX方法筛选出大肠肿瘤相关抗原基因并获得2个肿瘤抗原候选基因。

TIA重组cDNA表达克隆血清抗原基因的识别

目的:应用重组cDNA表达克隆血清学鉴定技术(SEREX)筛选与识别短暂性脑缺血发作(TIA)血清相关性抗原基因.方法:采集19例TIA患者血清,免疫筛选人主动脉内皮细胞cDNA表达文库;对阳性靶抗原行单克隆扩增,经单克隆内切除后转换载体pBluescript SK(+)提取质粒;对包含cDNA插入目的基因片段的质粒进行DNA序列检测,通过NCBI-BLAST同源性检索,鉴定具有免疫原性的独立的TIA重组cDNA表达克隆血清抗原基因.结果:(1)SEREX筛选出172个重组cDNA阳性单克隆;(2)单克隆内切除后获得167个pBluescript质粒,酶切鉴定质粒中均包含有目的基因插入片段;(3)生物信息学分析:识别11个独立的重组cDNA表达克隆抗原基因.(4)基因功能解析:发现matrix metalloproteinase 1(MMP1)、chromobox homolog 1(CBX1)和chromobox homolog 5(CBX5)与TIA和脑梗死(CI)的发生、发展关系密切.结论:应用SEREX技术成功筛选及鉴定出TIA相关靶抗原基因,发现MMP1、CBX1和CBX5可能与短暂性脑缺血发作(TIA)和脑梗死(CI)发生发展有关.

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因。方法采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率。以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析。结果成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42×106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0kb之间。文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因)。其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因。利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究。结论应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子。

肺癌相关抗原的血清学筛选与鉴定

目的：筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原,为肺癌早期诊断提供血清学标志物,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原。方法：5份异体肺癌患者血清采用重组cDNA表达文库的血清学分析（SEREX）技术对肺癌cDNA表达文库筛选;对阳性克隆插入片段进行测序、生物信息学分析。结果：①筛选出70个阳性克隆,插入片段大小为300-2800bp。②测序70个阳性克隆代表63个不同的基因。③生物信息学分析1个基因与肺癌的发生、发展关系密切;34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系,与其他肿瘤的发生、发展有关;26个基因的生理功能未见文献报道;2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因。结论：使用SEREX技术成功鉴定了一组肺癌相关的肿瘤抗原。

系统性红斑狼疮血管炎相关自身抗原的血清学筛选

目的通过重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术获得系统性红斑狼疮(SLE)血管炎相关自身抗体所对应自身抗原的cDNA序列。方法收集SLE病人血清作为筛选血清,采用SEREX技术筛选人微血管内皮细胞(HM VEC)cDNA文库。结果通过两轮筛选获得11个阳性克隆。通过生物信息学分析发现这11个阳性克隆cDNA序列编码三种不同的自身抗原,分别为SSA、SSB和YB-1。其中YB-1尚未被报道过与SLE血管炎相关。结论首次发现YB-1与SLE血管炎相关。通过SEREX技术,我们可能找到有助于SLE诊断、治疗和判断预后的自身抗原。

肺癌候选抗原的血清反应分析及其联合检测的应用

目的:通过重组cDNA表达文库血清学分析(SER-EX)技术筛选鉴定的5种肺癌候选抗原的血清学反应及其联合检测分析,对其能否作为肺癌早期诊断的血清学标志物进行评价,并提供一个肺癌早期诊断的新方向.方法:采用重组克隆抗原表达技术扩增5种肺癌候选抗原[分别是X5:二羟基苯甲酸内脂结合蛋白1配偶体(POB1);X18:DNA拓扑异构酶Ⅱα(Top2A);X44:中枢神经系肽酶Ⅰ(TPP1);X48:热休克蛋白90а(HSP90а);X52:真核翻译延长因子1γ(eukaryotic translation elongation factor 1 gamma)],免疫印迹法检测肺癌患者血清、正常人血清中自身抗体的反应,流行病学方法对其检测结果进行评价.结果:POB1,Top2A,HSP90а3个肺癌候选抗原克隆在肺癌患者血清和正常人血清中的相应IgG抗体阳性率差别有统计学意义(P<0.05);3个阳性反应抗原抗体反应联合分析时,能够在保持特异度等基本不变的前提下,明显提高诊断肺癌的灵敏度,具有较大的临床诊断价值.结论:3个抗原可作为肺癌的早期诊断的候选标志物,为肺癌的早期诊断提供了一个新的方向.

鼻咽癌相关肿瘤抗原基因的筛选及鉴定

目的通过筛选鼻咽癌肿瘤抗原,为鼻咽癌提供一个早期诊断指标;同时为进一步研究鼻咽癌的免疫治疗奠定基础。方法应用鼻咽癌细胞株异种免疫血清,采用血清学筛选重组cDNA表达文库(SEREX)技术对鼻咽癌cDNA表达文库进行筛选,对阳性克隆测序并进行生物信息学分析。W estern B lot检测鼻咽癌及正常人血清中阳性克隆的抗体。结果共筛选出18个阳性克隆,其中包括M AGE基因、CREM基因、2β-微球蛋白以及核糖体蛋白等已知基因或表达序列标签(EST),另外有6个基因或EST在G enB ank数据库中没有同源性,可能是新基因或EST。选取NPC-14、NPC-15、NPC-18克隆进行鼻咽癌患者及正常人群血清的检测,结果显示鼻咽癌患者的阳性率明显高于正常人群。结论所获得的未知基因产物有可能成为早期诊断鼻咽癌的血清学标志物。

SEREX方法筛选人胎盘抗原

目的筛选并获得来自人胎盘有潜在应用价值的抗原。方法基于血清学筛选重组cDNA表达文库(serological analysis of recombinant cDNA expression library,SEREX)技术,制备人绒毛组织免疫的兔血清,利用该免疫血清筛选人胎盘组织cDNA表达文库,通过两轮筛选得到免疫反应阳性的单克隆重组噬菌体并测序,并对所得到的序列进行生物信息学分析。结果经过两轮筛选共得到69个阳性反应克隆,序列分析发现它们代表12种不同的基因序列,其中功能已知基因9个,功能未知基因3个,进一步分析发现绒毛膜生长催乳激素基因(CSH1和CSH2)有57个阳性反应克隆,占总数的82.6%,可能是一个具有重要功能的抗原基因,所筛选到的其他基因与胚胎生长发育相关。结论SEREX技术筛选胎盘抗原是行之有效的,本实验筛选出的抗原基因对研究胚胎生长发育具有一定的意义。

肺癌抗原组中强免疫原性抗原的筛选

目的筛选肺癌抗原组中强免疫原性抗原,以期为肺癌的早期诊断、疫苗研制提供参考。方法选取5份异体肺癌患者血清以重组cDNA表达文库血清学分析(SEREX)技术筛选肺癌cDNA表达文库,并进行生物信息学分析。此外,选取2017年2月至2018年2月收治的肺癌患者60例为肺癌组,另取同期进行体检的正常人员60例为对照组。分别采集两组人员血清标本,对比相关肺癌抗原的异体血清反应结果。并对差异有统计学意义的肺癌抗原进行受试者工作特征(ROC)曲线分析,明确其在肺癌早期诊断中的价值。结果本实验共完成3轮血清学筛选,最终得到70个阳性克隆。采用NCBI网上序列分析软件BLAST对各cDNA序列的同源性进行比对,结果显示上述70个阳性克隆分别表示63个不同基因,包括35个已知基因、26个功能未知基因以及2个新基因。其中35个已知基因中仅有DNA拓扑异构酶Ⅱα(Top2A)基因与肺癌相关,2个新基因分别为热休克蛋白90α(HSP90α)、真核翻译延长因子1γ(EF-1γ),功能未知基因中可能与肺癌相关的包括二羟基苯甲酸内置结合蛋白1配偶体(POB1)、中枢神经系肽酶Ⅰ(TPP1),共5种肺癌相关抗原。肺癌组Top2A、HSP90α、POB1抗原克隆的IgG血清抗体阳性率高于对照组(P<0.01)。Top2A、HSP90α、POB1抗原克隆联合检测诊断肺癌的曲线下面积、敏感性、特异性高于上述三项指标单独检测(P<0.05)。结论SEREX技术可用于肺癌抗原组中强免疫原性抗原的筛选、鉴定,临床工作中可将Top2A、HSP90α、POB1基因作为肺癌早期诊断以及免疫治疗的靶向基因。