抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C7重轻链可变区基因的克隆及序列分析

应用分子生物学技术 ,从分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞 1C7中提取总RNA ,经反转录 ,PCR扩增及克隆 ,分别得到VH 基因及VL 基因。序列测定结果表明 :1C7的VH 基因为 36 8bp ,VL 基因为 32 3bp。用NCBIGenBank分析表明 ,VH 和VL 均符合小鼠抗体可变区特征 ,为功能性重排的抗体可变区基因。根据Kabat分类体系 ,1C7的VH 基因中的VH基因片段隶属于抗体重链第 7183家族 ,其VL 基因中的VL基因片段隶属于抗体K轻链 2 0家族 ,VH 基因由VH76_1BG_DFL16 .1_JH4重排而形成 ,VL 基因由VKbw2 0_JK2重排而形成。 1C7的VH 和VL

免疫球蛋白重轻链检测在浆细胞疾病中的应用进展

浆细胞疾病是以血或尿分泌单克隆免疫球蛋白(M蛋白)为特点的一组疾病,肿瘤特征显著。单克隆免疫球蛋白与肿瘤负荷及疾病缓解程度相关,是浆细胞疾病诊断、疗效评估、危险分层、疾病监测、预后判断的重要血清学指标。目前,血清蛋白电泳、免疫固定电泳和血清游离轻链是单克隆免疫球蛋白鉴别及分型的重要方法,但上述方法不能精确检测微小残留病灶,而血清重轻链检测对检出微小残留病灶具有高敏感性,成为浆细胞疾病诊疗的新型检测手段。血清重轻链(HLC)检测可特异性测定重链及轻链相关的完整免疫球蛋白水平,进而推算出HLC比值。本文就HLC比值及“HLC对抑制”对于浆细胞疾病的早期诊断、判断预后、危险分层、检测微小残留及指导用药方面的作用和价值作一综述。

血清重轻链检测在浆细胞病中的应用

单克隆免疫球蛋白(M蛋白)是单克隆浆细胞增殖性疾病诊断、预后分析及疗效评价的核心指标。目前,临床上主要应用血清蛋白电泳及免疫固定电泳对其进行测定。然而血清蛋白电泳对于含量较低或移动异常的M蛋白难以定量,而免疫固定电泳只能对M蛋白进行定性分型。血清重轻链(heavy and light chain,HLC)检测,作为一种新兴的M蛋白定量技术,可以特异性测定重链及轻链相关的免疫球蛋白水平。进一步计算HLC的比值,则可以反映疾病的单克隆浆细胞增殖程度。近年来,HLC检测已被应用于多种单克隆浆细胞增殖性疾病的研究,给此类疾病的诊疗带来新的检测手段。本文就HLC检测在该类疾病中的应用进行综述。

腹壁脂肪活检联合激光显微切割/质谱分析辅助诊断多发性骨髓瘤合并重轻链淀粉样变性1例报告

笔者在国内首次通过腹壁脂肪活检联合激光显微切割/质谱分析(LMD/MS)辅助诊断1例多发性骨髓瘤合并重轻链淀粉样变性患者,强调LMD/MS在淀粉样变性分型中的重要性。当心脏磁共振的钆延迟强化阴性,通过肌钙蛋白T、纵向弛豫时间定量成像与心肌细胞外容积可辅助诊断心肌淀粉样变性。

IgG型多发性骨髓瘤化疗后免疫球蛋白重/轻链表达及其与预后的关系

目的探讨Ig G型多发性骨髓瘤(MM)化疗后免疫球蛋白重/轻链(HLC)表达对预后的影响。方法回顾性分析70例Ig G型MM化疗后完全缓解(CR)患者的临床资料,分析患者化疗后单克隆免疫球蛋白HLC检测结果、复发情况与生存情况,明确HLC对预后的影响。结果 70例化疗后CR患者的血清蛋白电泳与免疫固定电泳M蛋白检测结果均为阴性。HLC检测发现r HLC异常21例,r FLC异常18例。r HLC正常与r HLC异常患者以及r FLC正常与r FLC异常患者在年龄、性别、Durie/Salmon分期、ISS分期方面比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05)。随访期间共7例复发,5例死亡。Cox回归分析显示r HLC与r FLC对患者无病生存时间无影响(P﹥0.05);r HLC为总生存时间的影响因素(P﹤0.05),而r FLC对总生存时间则无影响(P﹥0.05)。结论 Ig G型MM化疗后r HLC异常患者的生存时间会受到影响,HLC检测有助于预后判断。

抗红细胞H抗原单链抗体中可变区重链和轻链顺序对其活性的影响

目的探讨抗红细胞H抗原单链抗体(scFv)中可变区重链(VH)和轻链(VL)顺序对该单链抗体活性的影响。方法采用PCR方法从质粒pMD-18T-2E8scFv(VH-linker-VL型)中克隆出VL和VH可变区基因,通过重叠引物延伸法将这2种基因连接,并引入连接肽(linker)编码序列,构建VL-linker-VH型的单链抗体基因,将VL-linker-VH和原有的VH-linker-VL2种形式的单链抗体基因分别插入到原核表达载体pET-his中,转化BL21(DE3)plysS细胞,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用镍亲和层析柱纯化;免疫荧光法、竞争ELISA和低离子聚凝胺法检测纯化后scFv活性。结果酶切及测序表明VL-linker-VH型单链抗体表达载体构建成功,SDS-PAGE和Western blot分析表明VL-linker-VH和VH-linker-VL2型抗人红细胞scFv均在BL21菌中获得高效表达,重组蛋白的相对分子质量(Mr)为27kD,表达产物以包涵体形式存在,分别占菌体总蛋白的26.8%和27.6%,纯化后获得了高纯度的scFv;免疫荧光、竞争ELISA和低离子聚凝胺试验分析证明2种单链抗体均可特异结合红细胞表面H抗原,VH-linker-VL结合活性高于VL-linker-VH。结论成功制备了VL-linker-VH型2E8scFv;VH-linker-VL型2E8scFv抗原的纯合活性高于VL-linker-VH型2E8scFv。

抗肌球蛋白重链和轻链抗体在扩张型心肌病与冠心病鉴别诊断中的价值

目的 旨在探讨抗肌球蛋白重链和轻链抗体，在扩张型心肌病（DCM）和冠心病中鉴别诊断的价值。方法对21例DCM患者，14例冠心病患者及正常健康组18例，进行临床免疫学检测，应用ELISA法，免疫转印法检测数值予以分析。结果ELISA法DCM组阳性率43．9％，冠心病组28．6％，正常对照组均为阴性。免疫转印法21例的DCM患者抗肌球蛋白重链抗体（200KD）10例阳性，阳性率47.6％，冠心组抗肌球蛋白轻链抗体（27．SKD）阳性4例，阳性率28．6％，PBS替代试验均为阴性。结论抗心肌肌球蛋白重链和轻链的抗体检测有助于DCM和冠心病的鉴别诊断。

用免疫球蛋白重/轻链配对比值发现同一泳带IgG-κ和IgM-κ双M蛋白血症1例

目的初步鉴定M蛋白峰完全重叠的双M蛋白血症。方法用血清蛋白质电泳、免疫固定电泳、免疫球蛋白定量、并根据IgG、κ、λ定量推算IgG重/轻链配对比值,对患者血清进行综合鉴定。结果血清蛋白质电泳显示在γ区有1条明显的M蛋白峰,免疫球蛋白及轻链定量初步提示为IgM-κ型M蛋白;而重/轻链配对比值IgG-κ/IgG-λ>7.8,显著高于IgG-κ/IgG-λ比值正常上限2.7,提示同时存在IgG-κ型M蛋白;琼脂糖免疫固定和毛细管免疫固定均证实该患者存在IgG-κ型和IgM-κ型双M蛋白,2条M蛋白完全重叠。结论 2种单克隆M蛋白电泳条带完全重叠时,血清蛋白电泳无法区分,免疫球蛋白重/轻链配对比值可以用于免疫球蛋白克隆性的初步鉴别。

从单个B细胞扩增全人源抗体重链和轻链基因方法的建立

目的建立从单个B细胞扩增天然配对的B细胞受体(BCR)重链和轻链基因的方法。方法以用于亚洲人全基因组测序的"炎黄(YH)"细胞的永生化细胞系为材料,运用流式细胞术得到CD19+的单个B细胞,在单管里对单细胞进行裂解,获得总RNA,逆转录生成c DNA,两步巢式PCR扩增来源于同一个B细胞的天然配对的抗体重链和轻链,获得单个B细胞的全人源抗体的可变区序列信息。结果建立了稳定的单细胞BCR扩增方法,抗体基因扩增成功率高达80%以上。运用此方法,流式细胞术分选的单个B细胞在-80℃冻存2周以内仍能成功扩增;同一管里扩增产物经TA克隆和Sanger测序验证,既包含同一个B细胞的抗体重链基因,也包含其轻链基因,即含有天然抗体配对信息。自主设计和整理了一套行之有效的单细胞BCR引物。结论成功建立从单个B细胞扩增全人源抗体重链和轻链基因的方法。

IgG重/轻链比值对IgG型多发性骨髓瘤伴肾损伤化疗患者生存的预测

目的探讨免疫球蛋白G(IgG)重/轻链(HLC)比值在IgG型多发性骨髓瘤(MM)伴肾损伤患者中的表达,并分析其对患者化疗生存的预测价值。方法对2018年7月—2020年7月濮阳市人民医院收治的122例IgG型MM伴肾损伤患者进行前瞻性队列研究,入院后均参照《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2017年修订)》接受规范性治疗,对首次疗效评估为微小缓解以上患者进行为期2年的随访,同时检测上述患者化疗前、首次疗效评估时IgG的HLC比值及一般资料及化疗前其他实验室指标,观察不同HLC比值表达的IgG型MM伴肾损伤患者生存情况;同时分析不同生存状况患者HLC比值变化情况及分析影响患者预后的危险因素。结果122例患者中24例首次进行疗效评估时为微小缓解或疾病稳定或疾病进展,5例失访,3例中途放弃治疗,均给予剔除。最终93例IgG型MM伴肾损伤患者纳入本次研究。不同治疗效果患者化疗前HLC比值异常率比较,差异无统计学意义(P>0.05);化疗后,完全缓解者HLC比值异常率低于非常好的缓解、部分缓解者,且非常好的缓解HLC比值异常率低于部分缓解者(P<0.05)。以首次进行疗效评估时HLC比值进行分组,正常65例,异常28例。HLC比值异常组化疗前血清尿素氮(BUN)、β2-微球蛋白(β2-MG)、乳酸脱氢酶(LDH)水平均高于正常组(P<0.05);HLC比值异常患者2年生存时间(18.12±1.07)个月,低于正常表达患者(23.12±0.31)个月(χ^(2)=25.555,P<0.001)。随访2年,24例病死,病死率为25.81%,病死组ISS分期程度、化疗前血清BUN、β2-MG水平及游离轻链比值(rFLC)异常占比均高于正常组(P<0.05);病死组化疗前后HLC比值表达比较,差异无统计学意义(P>0.05);存活组化疗后HLC比值异常低于化疗前(P<0.05);Cox回归分析显示,ISS分期、化疗前BUN与β2-MG过表达、rFLC异常及化疗后HLC比值异常是IgG型MM伴肾损伤患者病死的独立危险因素(P<0.05)。结论HLC比值与IgG型MM伴肾损伤患者的临床预后有关,HLC比值异常可预测患者化疗后病死的风险。

免疫球蛋白重/轻链检测在IgA型多发性骨髓瘤患者预后判断中的作用

目的:观察疗效评估为非常好的部分缓解(VGPR)及以上的IgA型多发性骨髓瘤(MM)患者中血清免疫球蛋白重/轻链(HLC)和游离轻链(FLC)及免疫固定电泳(IFE)的结果,探讨HLC在IgA型MM患者疗效和预后评估中的作用。方法:收集54例治疗后疗效评估为VGPR及以上IgA型MM患者血清样本,采用散射免疫比浊法在全自动SPA plus特定蛋白分析仪上进行HLC及FLC检测。结合同期IFE检测结果,评价HLC在IgA型MM疗效及预后判断中的价值。结果:(1)54例IgA型MM患者中,22例rHLC(HLC IgA-κ/IgA-λ比值)异常,其中IgA-κ型13例,IgA-λ型9例,rHLC检测结果的中位数分别为4.30、0.29;rHLC异常组与rHLC正常组中位无进展生存期(PFS)分别为7.8个月与13.0个月(P=0.018);中位总生存期(OS)分别为11.2个月和13.2个月(P=0.048)。(2)54例患者中,15例IFE、rHLC、rFLC 3项指标均正常为A组;12例有1项指标异常为B组;18例有2项指标异常为C组;9例3项指标均异常为D组;A、B、C、D组中位PFS分别为16.6个月、14.2个月、7.8个月、7.0个月(P=0.019);中位OS分别为18.7个月、16.5个月、9.4个月、9.3个月(P=0.016)。结论:达到VGPR及以上疗效的MM患者仍能检出rHLC的异常,rHLC异常提示患者预后不良;HLC与FLC及IFE检测的联合应用可以更好地对IgA型MM患者进行预后监测。

抗B型葡萄球菌肠毒素高亲和力单链抗体的制备

目的构建针对B型葡萄球菌肠毒素(SEB)的特异性单链抗体(scFv),并进行纯化和鉴定。方法设计抗SEB高亲和力单克隆抗体(mAb)FMU-SEB-No.2重链和轻链可变区基因片段VH和VL的引物,利用RT-PCR技术,从本室制备的抗SEBmAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因片段;然后通过在轻链引物上设计linker序列,重叠引物延伸法(SOE)将VH和VL基因拼接成scFv基因片段,并将其克隆入原核表达载体PGEX4T-1中;转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,融合蛋白经谷胱甘肽亲和层吸柱纯化。采用SDS-PAGE,Western blot,ELISA等方法对其表达水平和特异性进行分析。结果成功从1株抗SEB mAb FMU-SEB-No.2杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL可变区基因,并通过linker序列将其拼接成scFv片段,大小约750 bp,编码250个氨基酸。PCR、酶切鉴定和测序结果表明表达载体构建成功。转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,以可溶形式表达相对分子质量(Mr)约54 000的融合蛋白。经谷胱甘肽亲和层析法纯化融合蛋白,可获得纯度达90%以上的scFv,ELISA和Western blot法检测结果表明,可溶性scFv与抗原SEB有较强的结合活性。结论成功构建并表达出抗SEB的特异性单链抗体。

三肽囊素抗独特型ScFv噬菌体展示文库的构建

利用在体外构建的三肽囊素抗独特型抗体可变区VH和VL基因,通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VLScFv,且ScFvDNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素抗独特型抗体全套单链噬菌体抗体库,并将该抗体库展示在噬菌体表面,以利用噬菌体展示技术的强大筛选能力筛选出与三肽囊素同功能单链抗体(Bursin-ScFv)。