生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化

目的轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3 L生物反应器微载体培养Vero细胞,观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001、0.002、0.010、0.040 MOI)、不同温度(34.5℃和35.5℃)、不同病毒收获时间(24和48 h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适MOI、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.002 MOI接种Vero细胞,温度为34.5℃培养病毒,滴度最高达7.50 lg CCID50/m L;48 h可连续收获4次病毒液,且收获总量及病毒滴度均高于24 h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Vero细胞培养条件的优化,获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法,为进一步规模化培养奠定了基础。

轮状病毒基因重配株血清型鉴定方法的研究

Ａ组轮状病毒中根据基因９的不同目前至少已发现有１３个不同Ｇ血清型，其中能引起人类致病的有Ｇ１－Ｇ４，Ｇ８，Ｇ９和Ｇ１２型。建立可靠的血清型鉴定技术对于轮状病毒疫苗的研制和分子流行病学的研究具有重要意义。本文首次报导了一种鉴定轮状病毒Ｇ血清型的新方法，利用已知有关轮状病毒ＶＰ７基因的序列资料，设计合成了一套鉴定轮状病毒Ｇ血清型的寡核苷酸探针，利用地高辛标记上述探针。待检品经反转录ＰＣＲ扩增后与上述一套寡核苷酸探针分别进行杂交得以确定其血清型。这一方法与目前常用的套式ＰＣＲ方法相比更适合于大量样品的操作而且结果可靠。用这一方法对本实验室组建的四株基因重配疫苗株进行实验，其结果与套式ＰＣＲ方法完全一致。

一例罕见G1P[8]-E2基因型轮状病毒重配株全基因序列分析

目的研究我国一例G1P[8]基因型A组轮状病毒(group A rotvirus,RVA)SC18511073的序列特征及进化规律,分析SC18511073与RotaTeq^(TM)和Rotarix^(TM)疫苗的抗原表位之间的差异。方法用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对SC18511073的11个节段进行RT-PCR扩增,利用在线RVA自动分型工具对其分型,采用DNAstar5.1和Mega11.0等软件对11个节段进行同源性及遗传进化分析。结果SC18511073全基因组基因型为G1P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E2-H1,NSP4为E2型。VP7和NSP3与同年份四川流行G1P[8]-E1型毒株同源性较高,系统进化树显示位于同一分支,其余9个基因节段均与我国流行的G9P[8]-E2型RVA高度同源,且归属于同一进化分支。SC18511073与RotaTeq^(TM)和Rotarix^(TM)在VP7的抗原表位中7-1a和7-2区域存在5个氨基酸差异;VP4蛋白裂解后的VP8^(*)抗原表位中8-1、8-3区域存在差异。结论我国2018年RVA毒株SC18511073为罕见的G1P[8]-E2型,推测是由G1P[8]-E1基因型与G9P[8]-E2基因型RVA毒株共感染过程中VP7和NSP3节段发生重配产生的新型毒株。SC18511073与RotaTeq^(TM)和Rotarix^(TM)在VP7和VP4上的抗原表位存在较多氨基酸位点差异。

轮状病毒基因重配株LD_9(G_2型)Vero细胞适应株的选育及其生物学特性

目的探讨轮状病毒基因重配株LD(9G2型)在Vero细胞上的传代适应性,选育高滴度的适应株。方法将3个轮状病毒基因重配株LD9克隆株(G2型)(LD9-1、LD9-2、LD9-3)在Vero细胞上分别以0.05、0.10、0.15和0.20MOI传代,选育出1株Vero细胞适应株,并确定其最适MOI,然后在Vero细胞上连续传代15代,检测病毒滴度及基因组核酸带型,采用nestRT-PCR法扩增其VP7基因。取第8、10、13代适应株病毒,以0.10MOI接种于Vero细胞,观察病毒的增殖动态。结果选育出的LD9-2株以0.10MOI接种Vero细胞可产生明显的细胞病变(CPE),病毒滴度随传代次数的增加先下降后升高,至4代时最低,9代后稳定于6.75lgCCID50/ml左右;连续传代15次,病毒基因组核酸带型均与原始毒株一致,且均能扩增出502bp的VP7基因。LD9-2株病毒增殖高峰期均出现在第7～8天,病毒滴度为6.00～7.00lgCCID50/ml。结论轮状病毒基因重配株LD9株(G2型)经Vero细胞适应性培养,获得了病毒表达量高且能稳定传代的疫苗候选株。

一种新的甲型流感病毒重配株(H1N2)来源的研究

3株H1N2亚型毒株基因分析表明, 它们仅HA基因节段类似于A/广东/6/91(H1N1)病毒, 即PR8类似毒株, 而其他7个基因节段均类似于1995年人群中流行的H3N2毒株, 故可认为新分离出H1N2亚型毒株是由PR8类毒株与1995年人群中流行的H3N2毒株通过基因重配而来. 由于1995与1998年分离到的H1N2毒株间基因组非常相似, 故可认为1998年分离到的H1N2毒株并不是由PR8类毒株与1998年人群中流行的H3N2毒株重配而来, 而是由1995年H1N2毒株演变而来.

轮状病毒基因重配LH9株(G4型)传代稳定性研究

对兰州生物制品研究所自行构建的轮状病毒基因重配株G4型LH9株在Vero细胞中传代的稳定性进行研究。将基因重配LH9毒株接种于Vero细胞上从7代传至17代,经电镜检查、病毒滴度测定、病毒基因组RNA电泳图谱分析、基因序列测定分析、轮状病毒型别鉴定及其它相关检定,结果均符合药典要求。证实该毒株为A群G4P〔12〕型轮状病毒,在Vero细胞传代中具有良好的稳定性,为疫苗研制提供安全有效的依据。

轮状病毒G9P[8]-E2基因型重配株在我国的流行趋势分析

目的研究我国轮状病毒(RV)流行毒株G9P[8]基因型的全序列分子特征及进化规律。方法采用反转录–聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,对2018年收集的64份(广东省深圳市和吉林省长春市各32份)G9P[8]基因型RV阳性标本进行扩增。结果成功获取54份(深圳市30份,长春市24份)G9P[8]基因型A组轮状病毒(RVA)标本的全基因组节段。序列分析表明,54份G9P[8]基因型RVA中, 28份为Wa-like G9P[8]-E1株,26份为非结构蛋白NSP4基因节段重配的G9P[8]-E2株,G9P[8]-E2株在深圳和长春市阳性样本中分别占60.0%、33.3%。结论 2018年深圳和长春市流行的RVA中G9P[8]-E2重配株已经成为优势株,且在深圳市的优势程度大于在长春市的,推测该基因型重配株RVA可能已在我国广泛传播。

轮状病毒LH9株在Vero细胞中的培养条件优化研究

为优化轮状病毒株在Vero细胞上的培养条件,将轮状病毒基因重配株LH9按0.1MOI分别接种于不同规格的细胞培养瓶(100ml、2000ml、3L、15L)。病毒接种采用吸附与未吸附两种方式、病毒收获采取低温冻融后离心与直接离心两种方法,观察分析对病毒滴度的影响。实验中,用CASY细胞计数仪分析活细胞率,病毒接种后逐日观察细胞病变(CPE)并取样,采用细胞半数感染量测定病毒滴度。结果表明,使用不同规格细胞培养瓶经吸附法培养接种、低温破碎法收获的LH9株病毒滴度高,其中以15L立瓶培养滴度最高(6.0～7.0 logCCID50/ml)。

Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗稳定性研究

为了研究Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗的稳定性,对2-8℃、25℃、37℃放置不同时间的9批成品疫苗定期取样观察外观物理性状、检测病毒滴度。结果表明,在2-8℃可保存两年以上,疫苗滴度保持不变;在25℃放置2周、37℃放置1周后疫苗滴度开始下降,因此,该疫苗在贮存、运输以及使用过程中环境温度应以2-8℃为宜。

一株G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定与全基因组序列分析

为了对患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛轮状病毒(BRV)的流行病学数据,本研究采用RT-PCR方法对8份腹泻犊牛的粪便样品进行BRV VP7基因检测,结果显示有1份样品为阳性。将该阳性病料样品接种Marc-145细胞。对产生细胞病变(CPE)的阳性样品连续传5代后,经间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察,结果表明从粪便样品中分离的病毒为BRV,命名为DZ株。对DZ株的11个基因节段进行RTPCR扩增、测序、拼接后对11个基因节段进行同源性及分型分析;构建分离病毒VP7、VP4基因进化树,分析其遗传进化关系及其氨基酸序列的变异情况。结果显示,DZ株基因组10个基因节段分别与来源于牛(VP2、VP7、NSP1、NSP3)、犬(VP3、NSP5)、羔羊(NSP2)、马(VP6)、猕猴(VP1)、人(NSP4)以及人-牛基因重配(VP4)的轮状病毒株。其中VP1基因与猕猴轮状病毒(RRV)的同源性最高,为81.3%,但低于VP1基因分型的临界值83%,因此DZ株的VP1为新出现的基因型,命名为R17;分离株NSP3基因与法国RF株NSP3基因的同源性高达98%,DZ株与RF株的NSP3属于同一基因型,命名为T18型。所以,本研究分离的BRV DZ株的基因型为G6-P5-I2-R17-C2-M2-A3-N2-T18-E2-H5。VP7和VP4基因遗传进化分析结果显示,DZ株VP7基因来源于韩国KJ69-1株,VP4基因来源于美国疫苗株RotaTeq-SC2-9。与同源性最高的病毒株相比,DZ株VP4、VP7蛋白氨基酸序列分别发生了9处和8处突变。这些突变可能会引起VP7和VP4蛋白的抗原性和组织嗜性变化,进而影响病毒的免疫原性、宿主嗜性以及致病性。综上所述,DZ株是多宿主来源的基因重配病毒株,且主要抗原蛋白VP7和VP4发生了较大变异。本研究为我国BRV遗传进化及其分子流行病学和疫苗的研究奠定了实验基础。

一株罕见G4P[6]-I5-A8基因型人轮状病毒全基因组序列分析

目的研究一株G4P[6]基因型A组轮状病毒(group A rotavirus,RVA)CZ079的全基因组特征及进化规律.方法利用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)对CZ079的VP7、VP4、VP6、NSP1节段分别进行RT-PCR扩增,通过在线RVA自动分型工具对其分型,采用DNAstar5.1和Mega 11.0软件对各节段进行同源性及遗传进化分析.结果CZ079毒株基因型为G4-P[6]-I5-R 1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1.VP6为I5型,NSP1为A8型.CZ079与LLR^(TM)、RotaTeq^(TM)和Rotarix^(TM)三种疫苗株在VP7的抗原表位中7-1b区域均存在氨基酸差异;VP4蛋白裂解后的VP8*抗原表位中8-1、8-2、8-3、8-4、5-1区域存在较大差异.结论2022年RVA毒株CZ079为罕见的G4P[6]-I5-A8型,推测该基因型RVA是由越南等东南亚地区传入中国,与中国RVA发生重配产生的新型重配毒株.

口服人-牛(WC_3株)5价轮状病毒基因重配活疫苗保护效果的Meta分析

目的评价口服人-牛(WC_3株)5价轮状病毒基因重配活疫苗(PRV)的保护效果。方法检索中国生物医学文献数据库等中文数据库和美国国家医学图书馆数据库等外文数据库,检索有关PRV保护效果的研究纳入分析。按照研究地区的社会经济发展水平、疫苗株和流行株的匹配情况,分别合并试验组和对照组针对不同型别轮状病毒感染引起的急性肠炎发病的相对危险度(RR)或比值比(OR),计算疫苗效力(VE)。结果共纳入5篇病例对照研究。高发展水平国家,在疫苗株和流行株完全匹配的情况下,VE=94%(95%CI:84%~98%);在疫苗株和流行株不完全匹配的情况下,VE=82%(95%CI:70%~89%);在单一抗原匹配的情况下,VE=82%(95%CI:70%~89%);在单一抗原不匹配的情况下,VE=75%(95%CI:47%~88%)。中等发展水平国家,在疫苗株和流行株不完全匹配的情况下,VE=37%(95%CI:10%~56%);在单一抗原匹配的情况下,VE=71%(95%CI:60%~78%);在单一抗原不匹配的情况下,VE=76%(95%CI:61%~85%)。结论接种PRV可降低轮状病毒感染引起的急性肠炎发病率,PRV的保护效果与疫苗株和流行株匹配情况以及地区因素有关。

有限稀释法筛选轮状病毒LD9株纯化方法的建立及应用

目的:建立有限稀释法克隆纯化轮状病毒的试验方法,筛选出感染性强、遗传特性稳定的轮状病毒基因重配株LD9。方法:梯度稀释LD9毒种,用5个稀释度(10-4～10-8)的病毒感染铺满单层Vero细胞的96孔板细胞,培养6 d,-20℃冻融,培养物传代至24孔板继续培养6 d,显微镜下观察细胞病变(CPE),-20℃冻融后检测。以相同方法重复克隆纯化3次,筛选获得病毒滴度稳定、具有稳定遗传特性的纯化病毒,由T25、T75到2,4,10层细胞工厂逐级放大培养。结果:筛选出适用于疫苗生产用的遗传特性稳定、感染性强的LD9疫苗候选株。结论:建立了适用于轮状病毒克隆纯化的筛选方法。

生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1的基因分析

目的分析生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1基因变异对病毒特性的影响。方法比较2005～2008年间上海生物制品研究所流感病毒H3N2型各疫苗株的生产数据,并对H3N2型各疫苗株的HA1基因序列数据进行分析。结果各疫苗株中,A/NewYork/55/2004(NYMCX-157)的血凝素得率最高,A/Brisbane/10/2007(IVR-147)最低;2006～2007年度疫苗候选株A/Wisconsin/67/2005(NYMCX-161B)的病毒复制能力优于A/Hiroshima/52/2005(IVR-142);各疫苗株的氨基酸差异均未直接涉及到HA1蛋白二硫键组成位点,直接涉及到HA1蛋白抗原决定簇位点、HA1蛋白糖基化位点和HA蛋白受体结合位点的变异分别有3处(140、156和193位)、1处(165位)和1处(225位)。结论2005～2008年间各流感病毒疫苗株血凝素得率因株而异,HA1蛋白抗原决定簇位点变异属于正常的不同毒株间的差异;糖基化位点、二硫键组成位点和受体结合位点基本保守;还需进一步研究部分位点氨基酸变异是否与病毒复制能力密切相关,并探讨改善复制能力的可能性。

2012-2019年新乡市B型流感病毒基因的变异及流行趋势

目的研究新乡市B型流感病毒的流行状况和基因变异特征,为当地流感疫苗接种提供政策依据。方法对新乡市2012年1月-2019年2月流感监测结果进行分析,随机抽取分离的23株B型流感病毒,进行血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因测序,使用DNAman软件进行序列比对,Neighbor-Joining法进行进化树分析。结果新乡市B型流感病毒Yamagata系(influenza B virus,Yamagata strain,BY)和Victoria系(influenza B virus,Victoria strain,BV)隔年交替流行,主要感染0~15岁人群(91.4%);2015-2016年和2017-2018年的优势株与当年的三价疫苗成分不符。HA基因进化树显示,87.5%(7/8)的BV株与疫苗株同处一个分支;而88.98%(8/9)的2013-2015年BY株与同期疫苗株不在一个分支,其抗原表位的突变位点有N116K、S150L、N165Y、D196N和N202S。NA基因未发现耐药位点突变。有6个分离株发生了系间重配。结论WHO推荐的三价疫苗株很多情况下与新乡B型流行株不符,推荐使用四价疫苗,并加强对15岁以下人群的接种;新乡BY流行株与疫苗株的HA基因差异较大,期待研发出适合我国本土的疫苗株。

甲型流感病毒X31(H3N2)小鼠适应后毒力增强与HA及PB2突变相关

流感小鼠适应毒株及感染模型是研究流感病毒致病机理、评价抗流感病毒药物和疫苗效果的重要工具。为建立甲型流感病毒X31(H3N2)的鼠肺适应毒株,并探讨其在小鼠适应过程中毒力增强的分子机制,本研究将X31在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,通过观察病毒滴度测定、感染小鼠症状变化、体重改变和致死力等指标,发现X31经过鼠肺连续传代10次以后,病毒毒力逐渐增强,与原代病毒相比,鼠肺中病毒滴度提高10倍,半数致死量(50%lethal dose,LD50)提高大于1 000倍。确定获得高致病力的鼠肺适应毒株(Mouse adapted X31,X31MA);对X31MA毒株全基因组测序发现,血凝素(Hemagglutinin,HA)基因出现3个有义突变(P221H、V309I、K411T),聚合酶碱性蛋白2(Basic protein 2,PB2)基因出现1个有义突变(M483T)。结果表明,通过在小鼠肺组织中连续传代X31(H3N2)致病力增强,其HA和PB2蛋白中四个适应性突变位点可能与流感病毒X31MA毒力增加相关。本研究为流感疫苗评价及致病机制研究提供了重要技术支持。