BvHIPP24介导甜菜应答镉胁迫的作用分析

为探究甜菜重金属相关异戊二烯化植物蛋白24(BvHIPP24)在重金属镉胁迫下的作用机制,本研究利用生信方法预测了该基因上游的顺式作用元件、转录因子和下游的互作蛋白,并分析了它们在镉胁迫下的转录表达特性。结果表明,BvHIPP24含有CGTCA-motif、生长素类、光响应、MYB结合、厌氧诱导和水杨酸应答相关的作用元件;转录因子BVRB_2g046790、BVRB_1g021800和BVRB_6g128880可能参与BvHIPP24的转录调控;BvHIPP24的互作蛋白主要包括SOD、NaKR1-like、COX1、MT2、NaKR3、REP1、RCA和LHCP等,它们可能通过与重金属离子结合参与离子运输和维持细胞内环境稳态。转录组测序结果表明BvHIPP24及互作蛋白的转录表达均受到镉胁迫的调控。综上推测,BvHIPP24主要通过上游转录因子的调控表达,直接或间接的与互作蛋白共同介导镉离子螯合及解毒。本研究为进一步揭示甜菜对镉胁迫的响应机制提供了参考。

能源甜菜BvHIPP24基因的特性及在酵母中的镉耐受功能分析

为了进一步研究重金属相关异戊二烯化植物蛋白在重金属逆境下的解毒机制,本研究克隆了能源甜菜BvHIPP24基因并分析了其在镉逆境下酵母中的功能。本研究以能源甜菜为实验材料,利用RTPCR的方法克隆获得能源甜菜BvHIPP24基因,并对BvHIPP24基因进行生物信息学分析;利用酵母表达载体构建pYES2-BvHIPP24重组质粒并转化到酵母InVSc1,在真核酵母细胞中进行BvHIPP24基因应答镉胁迫的研究。生物信息学分析显示BvHIPP24基因的CDS全长444 bp,编码147个氨基酸,氨基酸序列的分子量为16377.34 Da,理论等电点为9.39,为亲水蛋白,不含有跨膜区域,定位于叶绿体。保守结构域分析该基因具有一个HMA结构域。构建进化树分析表明,能源甜菜BvHIPP24蛋白与BvHIPP23蛋白质具有较近的亲缘关系。当施加0.5 mmol/L CdCl_(2)胁迫后,适量表达BvHIPP24的重组菌与对照菌株相比,其生长趋势明显优于后者,并发挥着相对更高的Cd耐受性。这说明,能源甜菜BvHIPP24基因在镉逆境胁迫下发挥着重要的解毒作用,并有可能直接或间接参与细胞重金属离子吸收、转运及代谢平衡等过程。

镉逆境胁迫下甜菜BvHIPP24基因在大肠杆菌的功能分析

重金属关联异戊二烯化植物蛋白(Heavy metal-associated isoprenylated plant proteins,HIPPs)由于其独特的重金属结合域(heavy metal associated domains,HMA)和异戊二烯序列(isoprenylation motif)的结构特点,使其成为一类重要的金属分子伴侣(Metallochaperones)。本研究利用RT-PCR的方法,从甜菜体内克隆获得了Beta vulgaris heavy metal-associated isoprenylated plant protein24(BvHIPP24)基因。该基因CDS全长为444 bp,编码了147个氨基酸,分子量为16.38 kDa。利用大肠杆菌表达载体构建pEASY-Blunt E1-BvHIPP24重组质粒,并转化到BL21中。通过1 mmol/L IPTG诱导发现:在0.5 mmol/L Cd2+逆境胁迫下,表达BvHIPP24重组菌的生长趋势要明显优于对照菌株,并具有更高的Cd耐受性。因此可以推断,甜菜BvHIPP24基因在镉逆境胁迫过程中发挥着重要的作用,并有可能参与到甜菜细胞重金属离子吸收、转运、区隔以及代谢平衡调控过程中。

茶树‘黄金芽’CsHIPP26.1基因克隆与光响应表达分析

本研究以茶树(Camellia sinensis)‘黄金芽’芽下第二叶为材料,克隆了前期蛋白组学分析获得的一个响应光强变化且在‘黄金芽’中高表达的重金属相关异戊二烯化植物蛋白(HIPP)基因,将其命名为CsHIPP26.1, GenBank登记号:MK654903。该基因c DNA全长为465 bp,编码154个氨基酸,蛋白分子质量为17.01 kDa;理论等电点为9.13,无跨膜结构域;共有16个磷酸化位点,位于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸三个氨基酸残基上;二级结构中含α螺旋28.6%、310螺旋3.9%、β折叠32.5%、β转角6.5%,此外还含无序化区域28.6%,且主要分布于N端和C端;亚细胞定位于核中。以不同遮荫度‘黄金芽’新梢为材料进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)实验,结果显示CsHIPP26.1表达响应光照强度变化,且随光照强度增大表达量增加;将CsHIPP26.1转化苹果(Malus pumila)‘王林’愈伤组织,能助其在强光下正常生长。