链间二硫键改善FⅧ基因断裂转移小鼠血浆重链分泌和凝血活性

体外细胞培养实验证明,双载体共转重链A2结构域Met662和轻链A3结构域Asp1828突变为Cys的B区缺失型凝血Ⅷ因子(BDD-FⅧ)基因可使共表达的重、轻链形成链间二硫键,重链的分泌水平得到改善.本文进一步观察小鼠体内双载体转此突变体BDD-FⅧ基因后血浆中重链的分泌量和凝血活性.构建一对含Cys662突变重链和Cys1828突变轻链真核表达载体,经门静脉注射双表达载体至C57BL/6小鼠体内,用ELISA法和Coatest法分别检测小鼠血浆中重链的分泌量和凝血活性为(239±56)ng/mL和(1.09±0.25)IU/mL,明显高于双载体共转野生型BDD-FⅧ基因对照小鼠((84±25)ng/mL和(0.36±0.12)IU/mL).结果表明,链间二硫键形成可有效增强转基因小鼠的血浆重链分泌,提高血浆凝血活性,改善双载体转BDD-FⅧ基因功效,为后续应用双AAV载体的血友病基因治疗研究提供实验依据.

脱氧萎镰菌醇通过下调GRP78提高双链转FVⅢ基因细胞分泌重链和生物活性

双链转凝血VⅢ因子(FVⅢ)基因是克服AAV载体容量限制的有效方法,但重链分泌的低效性带来链不均衡性。本文旨在用脱氧萎镰菌醇(deoxynivalenol,DON)降解内质网分子伴侣蛋白GRP78,通过减少重链与GRP78的结合提高重链分泌,改善双链转FVⅢ基因的功效。用DON处理双链共转基因细胞,观察了双链转FVⅢ基因293细胞分泌的重链和FVⅢ活性。结果显示,用500 ng.mL-1 DON处理细胞3 h后,GRP78蛋白水平明显降低,细胞的生长不受明显影响;单独转FVIII重链基因的DON处理细胞分泌的重链量[(59±11)ng.mL-1]明显高于对照细胞[(15±4)ng.mL-1],双链共转基因时重链的分泌量进一步增加,为(146±34)ng.mL-1,活性达到(0.66±0.15)U.mL-1,明显高于双链转基因对照细胞[分别为(76±17)ng.mL-1和(0.35±0.09)U.mL-1]。结果表明,DON可通过下调GRP78改善重链的分泌性,提高双链转FVⅢ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FVⅢ基因提供了实验依据。

BiP表达下调改善双载体转断裂FⅧ基因的功效

双载体转凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因可作为一种转基因策略克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但重链分泌的低效性影响转基因功效.为提高重链分泌,本文用RNA干扰技术下调内质网内蛋白伴侣分子免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)的表达,观察对HEK293细胞双载体共转FⅧ基因分泌重链和生物活性的影响.结果显示,RNA干扰可明显下调BiP表达,但不影响细胞生长;ELISA检测BiP下调细胞单独转重链基因时的重链分泌量为98±38 ng/mL,与轻链共转基因时显著升高到157±32 ng/mL,明显高于对照细胞单独转重链基因和共转重链和轻链基因的重链分泌量(分别为29±8 ng/mL和79±19 ng/mL);Cotest法检测显示,BiP下调细胞共转重链和轻链基因细胞分泌的凝血生物活性为0.73±0.23 IU/mL,明显高于对照细胞共转重链和轻链基因(0.39±0.07 IU/mL).结果表明,BiP表达下调通过促进重链分泌,可提高双载体共转FⅧ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了实验依据.

双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FⅧ基因

用双载体转运凝血Ⅷ因子基因在甲型血友病基因治疗研究中可克服AAV毒载体容量限制,但存在重链分泌低效和链不均衡性问题。为探索重、轻链间二硫键形成对重链分泌的促进作用,该文用双载体转B结构域大部缺失型FⅧ(BDD-FVⅢ)的重链和轻链基因,将重链的Tyr664和轻链Thr1826突变为Cys,研究了HEK293细胞共转基因后的基因表达、分泌至培养上清的重链量和凝血生物活性。用Western blot检测细胞裂解液结果显示,非还原条件下有明显的二硫键交联的重、轻链蛋白;链特异性ELISA定量检测细胞分泌的重链为(125±29)ng/mL,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞的(75±23)ng/mL;Coatest法显示细胞分泌的凝血活性为(0.78±0.29)U/mL,也明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞(0.34±0.12)U/mL。结果表明,重、轻链间的二硫键形成可提高双载体转FⅧ基因的功效,为进一步在动物体内转基因提供了实验依据。