羊驼非免疫重链单域抗体库的构建和鉴定

本研究旨在通过构建羊驼非免疫重链单域抗体库,完成抗体库多样性的鉴定,为进一步筛选抗原特异性重链抗体奠定基础。我们从未经免疫的羊驼外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC),抽提RNA后,用RT-PCR方法特异性扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段;并采用两步连接方法将重链抗体可变区片段与噬菌粒载体pCANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠杆菌TG1后获得VHH抗体基因库;并采用稀释计数法测定抗体库库容量,随机挑取克隆测序验证抗体库多样性。结果显示,我们所构建的羊驼非免疫重链单域抗体库的库容量为1.5×109,随机克隆测序验证多样性良好,独立克隆所占比例为80%,并显示出和人源抗体较高的同源性。上述结果表明,我们已经成功构建获得大容量的羊驼非免疫重链单域抗体库,为进一步筛选抗原特异性重链抗体奠定基础。

重组人胱抑素C重链单域抗体的制备

研究在大肠杆菌中表达重组人胱抑素C(Cystatin C,Cys C)重链单域抗体(Variable domain of the heavy chain of heavy-chain antibody,VHH),经纯化和复性后,建立测定人血清Cys C的胶乳增强免疫比浊法(Particle enhanced turbidimetric immunoassay,PETIA)。根据大肠杆菌编码蛋白的特性设计Cys C重链单域抗体编码基因序列,人工合成目的基因克隆至PET32a(+)载体中,构建重组人Cys C重链单域抗体原核表达质粒PET32a(+)-Cys C重链单域抗体,测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,所获得的目的抗体经Ni-NTA亲和层析法进行纯化,通过稀释复性,SDS-PAGE鉴定其纯度。Cys C重链单域抗体化学偶联胶乳颗粒,建立PETIA法测定人血清Cys C。SDS-PAGE电泳分析显示,表达的Cys C重链单域抗体相对分子质量约为53 k,经Ni-NTA亲和层析法纯化后抗体纯度达90%以上,复性回收率为60%左右。用Cys C重链单域抗体建立的测定人血清Cys C的PETIA,能检测到血清中的Cys C含量。成功构建Cys C重链单域抗体原核表达系统并获得了有活性的Cys C重链单域抗体,该抗体可用于建立测定Cys C的PETIA法,为下一步开发Cys C的免疫检测试剂盒奠定了基础。

抗AFB_1单域重链抗体文库淘选方法的研究

比较两种从噬菌体展示文库中淘选抗黄曲霉毒素B1单域重链抗体的方法,并为淘选针对小分子物质的单域重链抗体提供参考。采用固相淘选技术,以黄曲霉毒素B1人工抗原为靶分子,淘选天然单域重链抗体库,分别采用Gly-HCl法和AFB1竞争法洗脱结合噬菌体,对洗脱物进行滴度测定,以回收率和富集度为指标,对两种洗脱方法进行比较。采用phage-ELISA法鉴定噬菌体克隆,并对阳性克隆进行交叉反应分析以及序列测定。滴度测定结果显示,Gly-HCl法回收率比竞争法高5～10倍。分别随机挑取20个单克隆进行phage-ELISA鉴定,其中,Gly-HCl洗脱法未获得阳性克隆,AFB1竞争洗脱法得到8个阳性克隆。序列测定结果显示,这8个克隆均编码单域重链抗体。

半巢式PCR法构建天然噬菌体单域重链抗体文库

目的:构建天然噬菌体单域重链抗体文库,淘选可应用于食品安全检测的单域重链抗体。方法:以未经免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血为起始材料,提取RNA反转录为cDNA,根据重链抗体保守序列设计引物,通过半巢式PCR法扩增获得全套重链抗体可变区编码基因,将其克隆至噬菌粒pHEN1,电转化大肠杆菌TG1得到初级抗体库,辅助噬菌体KM13感染后得到噬菌体展示库。采用固相淘选法分别对3种人工抗原进行淘选。结果:单域重链抗体编码基因得到有效扩增,经10次电转化获得初级文库,命名为SNAL,实际库容量达到1.6×107个独立克隆,菌落PCR鉴定结果表明,克隆效率约为87%,辅助噬菌体救援后得到的展示文库命名为SNA-PDL,滴度达1013CFU/mL。对3种不同人工抗原DON-MBSA、NOR-BSA和AFB1-OVA的淘选均有富集现象。结论:构建了天然噬菌体单域重链抗体文库,文库的多样性较好,可以用于后续淘选。

基于重链抗体构建的单域抗体研究进展

在骆驼血清中存在天然的缺失轻链的重链抗体(heavy chainantibody ,HCAb) ,克隆重链抗体的可变区构建的只由一个重链可变区组成的单域抗体称为VHH抗体(variabledomainofheavychainofheavy chainantibody ,VHH)。研究发现,VHH抗体具有易表达、可溶性好、稳定性强等优点。另外,骆驼的重链抗体与人VH3家族抗体同源,对人VH3家族抗体的重链可变区进行类似VHH的特征性改造,可以使这些抗体在保持亲和力、特异性不变或者变化很小的情况下,优化抗体的其它性质。已有的研究表明VHH抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。

单域重链抗体的分子特征

源于软骨鱼或骆驼科动物的同型重链二聚体无轻链,用基因工程方法获得其单一重链可变区可保留完整的抗原结合活性,称为单域重链抗体。单域重链抗体具有分子小、稳定性高、体内组织渗透性好、可溶性好、易表达、抗原识别表位独特的结构特征,近年来在生物技术研究与诊断治疗应用领域得到广泛关注,取得了快速发展。

结核分枝杆菌Rv0733-6His抗原羊驼单域重链抗体的筛选与鉴定

单域重链抗体是目前中和胞内病原体抗原的重要分子之一,研究以结核分枝杆菌Rv0733-6His融合抗原为靶标,对羊驼非免疫单域重链抗体库进行了3轮淘洗,通过ELISA和测序方法,从1 024个克隆中筛选出10个独立单域重链抗体序列,继而用原核表达并鉴定了1株Rv0733-VHH-Fc-6His抗体。免疫印迹和免疫荧光结果均显示Rv0733-VHH-Fc-6His抗体可以特异性地结合Rv0733抗原。提示Rv0733-VHH抗体可能具备结合胞内菌相关抗原的潜力。

一种构建改形单域抗体的方法(英文)

为验证一种构建改形单域抗体的实用新方法 ,与以往方法不同的是 ,该方法不需要对抗体进行空间结构模拟 ,以确定人源抗体的FRs接受序列及在人源FRs接受序列中哪些氨基酸残基需要突变 ,并且该方法将抗体的改形与亲和力成熟于同一过程完成。利用该方法构建了改形抗CD2 8重链单域抗体。根据一种鼠源抗CD2 8重链单域抗体的氨基酸序列 ,于GenBank中查得两条与之最同源的人源抗体序列 ,利用其中一条的FRs作为改形抗体的主框架进行改形构建。将鼠源抗体的CDR区插入到人源FR区后 ,对人源FR区的一些氨基酸残基进行替换突变 ,替换的氨基酸残基数及替换原则主要是根据对查到的人源抗体序列、鼠源抗体序列 ,以及这些序列与Kabat分类中的种属序列进行的比较。为了增加改形抗体基因的多样性 ,对要被替换的氨基酸残基在基因合成中采用简并的方式 ,使要被替换的氨基酸残基和替换的氨基酸残基都有机会出现 ,二者出现的几率各为 5 0 %。同时 ,在将大小不同的合成核苷酸片段采用重叠PCR扩增以获得完整改形抗体基因时 ,采用高Mg2 + 浓度下和使用TaqDNA聚合酶 ,以进一步随机引入突变。利用重叠PCR产物构建了一个噬菌体抗体库 ,经过 3轮淘选后 ,获得了几个具有较高免疫学活性的改形抗体。对其中的两个抗体进行了进一步研究 ,将?

驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定

从未经主动免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录后作为第一轮PCR的模板。根据重链抗体保守区域设计引物,经巢式PCR法扩增获得了全套重链抗体可变区基因,将其克隆至噬菌粒pHEN1,电转化大肠杆菌TG1得到初级抗体库NAL,含有2×107个独立克隆,菌落PCR和Hinf I酶切分析结果显示,克隆效率大于97%,文库的多样性良好。辅助噬菌体救援后,得到噬菌体展示文库命名为NA-PDL,滴度达1013CFU/ml。以真菌毒素人工抗原DON-MBSA为目标抗原,对NA-PDL进行了淘选,第二轮洗脱物中,阳性克隆率达36.4%,提示针对目标抗原的噬菌体颗粒得到了有效富集,文库NA-PDL多样性较好,为后续淘选针对特定抗原的单域重链抗体奠定了基础。

基于细胞的抗单增李斯特菌单域重链抗体的筛选及鉴定

【目的】获得针对单增李斯特菌的特异性单域重链抗体,并对筛选过程中特异性克隆的富集规律进行分析,为筛选具有种属特异性的噬菌体展示抗体提供参考。【方法】采用固相筛选技术,以热灭活的单增李斯特菌菌体为抗原,通过四轮常规筛选和一轮消减筛选,从驼源天然噬菌体展示文库中筛选针对单增李斯特菌的单域重链抗体。采用Phage-ELISA法,对后四轮筛选洗脱物中随机挑选的噬菌体进行鉴定,阳性克隆进行基因测序及结合特异性分析。通过多序列比对分析将获得的基因序列进行分组和统计。【结果】成功筛选到2株单增李斯特菌特异性的单域重链抗体。【结论】在优化的筛选条件下,基于全细胞的筛选方法能够获得特异性识别单增李斯特菌的单域重链抗体,消减筛选对于去除非特异性克隆是有效的和必要的。

基于CDR2和CDR3区随机突变筛选抗黄曲霉毒素B1单域重链抗体的研究

基于抗原-抗体特异性反应的免疫学方法是黄曲霉毒素B1的常用检测方法。为制备针对AFB1的抗体,综合参考已报道的噬菌体文库筛选的抗AFB1单域重链抗体(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)序列,合成一条经密码子优化[适于大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)表达]的高同源性序列。在抗AFB1 VHH的CDR2和CDR3区引入部分随机突变,构建噬菌体抗体库。采用phage-ELISA技术,以AFB1O-OVA为包被抗原,淘选单域重链抗体库,经过4轮筛选,获得15株能与AFB1特异性结合的阳性克隆。以结合力最高的1株克隆为材料,扩增相应的VHH基因,构建表达质粒p ET-22b-VHH。在E.coli BL21(DE3)中表达VHH,经间接竞争ELISA分析,获得的抗AFB1 VHH的灵敏度约为10μg/m L。

单域抗体的研究和应用进展

传统IgG抗体分子一般由轻链和重链组成,轻链包含1个可变区(VL)和1个恒定区(CL),重链包含1个可变区(VH)和3个恒定区(CH1,CH2,CH3)。单域抗体(Single domain antibody,sdAb),是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体,因其分子量小,也被称为纳米抗体(Nanobody)。20世纪90年代,单域抗体最早在骆驼科动物中被发现,之后在护士鲨、大星鲨和鳐鱼等软骨鱼纲动物中也发现了类似的抗体。单域抗体虽然结构简单,但仍然可以达到与传统抗体相当甚至更高的与特异抗原结合的亲和力。相比于传统抗体,单域抗体具有分子量小、稳定性强、易于重组表达等优点。近年来在生物学基础研究和医学临床应用方面均备受关注并被广泛应用。文中将从单域抗体的结构特征、理化性质、筛选方法及其在生物医学领域的重要应用进展进行综述。

抗磺胺二甲氧嘧啶VHH抗体噬菌体库的构建和鉴定

旨在制备抗磺胺二甲氧嘧啶(SDM)驼源单域重链(VHH)抗体,用于检测动物源性食品中SDM的残留。采用重氮化法,SDM分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫原(SDM-BSA)和包被抗原(SDM-OVA)。用SDM-BSA免疫骆驼,在第5次免疫后1周采集骆驼外周血液,分离外周血淋巴细胞,提取RNA,RT-PCR扩增VHH基因,将VHH基因插入pCANTAB-5E噬菌粒载体,构建双峰驼单域重链抗体库。经本实验室前期测定其库容为1.08×10^(5) CFU,阳性率为96.6%。利用噬菌体展示技术经过4轮生物淘选,筛选获得特异性表达抗SDM抗体的重组噬菌体。结果:构建了SDM的驼源VHH抗体库,经生物淘选及phage ELISA检测获得了特异性的重组噬菌体。通过4轮生物淘选,获得了能够与SDM-OVA抗原有明显结合力且能够特异性表达抗SDM抗体的重组噬菌体,为后期检测SDM在动物源性食品残留奠定了良好的基础。