非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A羧基端蛋白的真核表达及在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞中的作用

前期研究结果证明抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的抗独特型抗体特异性结合Marc-145细胞上的非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A,NMHCⅡ-A)蛋白,其结合位点位于NMHCⅡ-A的羧基端。本研究通过真核表达NMHCⅡ-A的羧基端(PRA)蛋白,验证其对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达PRA蛋白。Western blot和间接免疫荧光鉴定PRA蛋白的表达及其与Marc-145细胞的结合。通过病毒中和试验、荧光聚焦中和试验和荧光定量PCR检测PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。Western blot和间接免疫荧光结果表明,PRA蛋白在真核细胞中得到成功表达,其最高表达量为接种1个MOI杆状病毒后96h时。PRA蛋白特异性结合Marc-145细胞,使PRRSV感染Marc-145细胞延迟24h并且感染效率降低60%。真核表达的NMHCⅡ-A羧基端蛋白能特异性结合Marc-145细胞并有效降低PRRSV的感染。这些结果为进一步阐明NMHCⅡ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用提供了新的依据。

黄芪皂甙和丹参酮ⅡA对大鼠骨骼肌急性钝挫伤后胚胎型肌球蛋白重链和波形蛋白表达的影响

目的:观察黄芪皂甙和丹参酮ⅡA对大鼠骨骼肌急性钝挫伤后胚胎型肌球蛋白重链(embryonic Myosin Heavy Chain,MHC-emb)和波形蛋白(vimentin)表达的影响。方法:80只雄性Wistar大鼠(体重180～200g)随机分为A组(黄芪皂甙组)、B组(丹参酮ⅡA组)、C组(黄芪皂甙+丹参酮ⅡA组)、D组(黄芪丹参注射液组)、E组(生理盐水对照组),每组16只。采用打击装置造成右侧腓肠肌中段钝挫伤模型,分别于损伤局部注射相应药物,并于损伤后4、7、14和28天进行腓肠肌损伤部位取材。Western Blotting方法检测各组MHC-emb和波形蛋白表达量的变化。结果:①与生理盐水组相比,各干预组MHC-emb表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),这种情况一直持续到伤后28天;其中又以C组和D组升高最为明显;②与生理盐水组相比,各干预组波形蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),这种情况一直持续到伤后28天;其中又以C组和D组降低最为明显。结论:在急性骨骼肌钝挫伤修复过程中,黄芪皂甙、丹参酮ⅡA均能促进MHC-embmRNA表达,抑制波形蛋白mRNA表达,联合使用时效果最佳,与黄芪丹参复方成分基本一致。

A型肉毒杆菌神经毒素重链干预大鼠脊髓损伤后蛋白表达的初步研究

目的:初步观察大鼠脊髓损伤模型基础上局部注射小剂量A型肉毒杆菌神经毒素重链(BoNT/A HC)后对局部蛋白表达谱的影响,为探讨BoNT/A HC干预在体神经损伤后相关蛋白表达及其干预神经再生机制提供实验基础。方法:复制大鼠单侧腰段脊髓损伤模型;采用SDS-PAGE及双向电泳观察不同剂量BoNT/A HC(2μg、4μg、6μg和8μg)对脊髓损伤后局部(包括损伤部位及其近头端部分脊髓组织)蛋白表达谱的干预作用。结果:大鼠单侧腰段脊髓损伤2 d时局部脊髓组织结构明显破坏崩解,损伤波及左侧脊髓灰质及白质;脊髓损伤局部SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色显示,于损伤同时局部一次性注射不同剂量BoNT/A HC后,某些蛋白表达与单纯损伤组相比明显不同,而与正常组基本一致;双向电泳结果进一步显示,损伤局部注射6μg BoNT/A HC后2 d和20 d时,在不同等电点及不同蛋白分子量水平上,有10余种蛋白表达与单纯损伤组明显不同,呈向正常转化的趋势。结论:大鼠脊髓损伤局部注射BoNT/A HC一定时间可影响损伤局部蛋白表达谱的变化,这种变化呈现由损伤造成的蛋白表达变化被转向正常的趋势。

青白散对慢性软组织损伤大鼠骨骼肌Ⅱb型肌球蛋白重链及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响

目的观察青白散对慢性软组织损伤大鼠骨骼肌中Ⅱb型肌球蛋白重链(myosin heavy chain;MHC)及Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagen-Ⅰ和collagen-Ⅲ)蛋白表达的影响。方法 72只雄性SD大鼠随机分为模型对照组、云南白药组、青白散组,每组24只。采用慢性软组织损伤动物模型,分别予以生理盐水、云南白药和青白散灌胃。于给药后第1周末、第2周末、第3周末,用免疫组织化学方法检测大鼠慢性软组织损伤后骨骼肌中MHC-Ⅱb蛋白及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达,并分析其相关性。结果青白散组在不同时间点的骨骼肌中MHC-Ⅱb蛋白表达水平均较模型对照组显著增高,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达水平均较模型对照组显著降低。结论青白散能显著促进大鼠慢性损伤骨骼肌中MHC-Ⅱb蛋白表达,阻止Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达过度增高,从而有利于损伤组织的修复。

转人类胰岛素样生长因子-Ⅰ基因成肌细胞对骨骼肌急性钝挫伤后Ⅱb型肌球蛋白重链及波形蛋白mRNA表达的影响

目的:观察转人类胰岛素样生长因子-Ⅰ(HumanInsulin -likeGrowthFactor-Ⅰ,hIGF -Ⅰ)基因成肌细胞回输小鼠骨骼肌钝挫伤局部后,对小鼠骨骼肌愈合过程中Ⅱb型肌球蛋白重链(MyosinHeavyChain -Ⅱb ,MHC -Ⅱb)及波形蛋白(Vimentin)mRNA表达的影响。方法:将90只7～12周雄性C3H小鼠右下肢腓肠肌中段内侧实施急性钝挫伤后,随机分为自然愈合组、单纯成肌细胞注射组和转基因成肌细胞注射组。挫伤后第3天,对单纯成肌细胞注射组、转基因成肌细胞注射组损伤局部分别注射等量单纯成肌细胞和转基因成肌细胞,并于损伤后第1、5、10、2 0、30天取材。检测不同时间点MHC -Ⅱb和VimentinmRNA表达水平,观察比较各组骨骼肌修复情况。结果:(1)在急性骨骼肌钝挫伤修复期,3组小鼠骨骼肌MHC -ⅡbmRNA均明显升高,第2 0天达到峰值。转基因成肌细胞注射组MHC -ⅡbmRNA表达水平最高,其次为单纯成肌细胞注射组。(2 )急性骨骼肌钝挫伤修复过程中,转基因成肌细胞注射组VimentinmRNA的表达水平始终在3组中表达最低。结论:急性骨骼肌钝挫伤修复过程中,注射转基因成肌细胞能提高损伤后MHC -IIbmR NA表达水平,促进肌纤维的增生,加速骨骼肌愈合进程。同时,损伤局部注射转hIGF -Ⅰ基因的成肌细胞后,使得损伤局部VimentinmRNA表达低于另两组。

A型肉毒素重链干预神经细胞组蛋白3乙酰化水平的初步研究

目的通过对离体神经细胞培养及大鼠在体脊髓损伤模型施予BoNT/A重链,观察损伤局部组蛋白乙酰化水平的变化,为探讨BoNT/A重链干预神经细胞再生的分子机制提供实验依据。方法将BoNT/A重链加入细胞培养液或在脊髓损伤模型基础上局部给予小剂量BoNT/A重链;收集细胞及损伤局部脊髓组织,采用免疫荧光、SDS-PAGE和Western blot等方法对细胞和脊髓组织内选择性组蛋白亚类的乙酰化水平进行检测。结果不论是体内应用还是培养液内加入BoNT/A重链,细胞和组织内组蛋白3的乙酰化水平皆明显增多;BoNT/A重链所致的Neuro-2a细胞组蛋白3乙酰化水平的增高与神经突起的增长相匹配,即同一时间点组蛋白乙酰化水平显著增高的同时,神经突起的生长也呈显著增长;脊髓损伤基础上给予BoNT/A重链所显示的组蛋白3乙酰化的表达量增高呈现双时相高峰(2 h和48 h)。结论 BoNT/A重链可促进组蛋白3的乙酰化;在同一时间点,组蛋白3的乙酰化水平与神经突起增长的长度相一致;组蛋白3乙酰化可能是BoNT/A重链促神经突起生长的相关机制之一。

A型肉毒毒素重链对大鼠脊髓损伤局部颈上神经节蛋白10的表达及神经突起再生的影响

目的:探讨人工重组A型肉毒毒素重链(BoNT/A重链)对大鼠脊髓损伤局部颈上神经节蛋白10(SCG10)表达、神经突起再生以及损伤侧后肢感觉及运动功能的影响,为阐明BoNT/A重链促神经突起生长的作用提供实验依据。方法:大鼠单侧腰段脊髓横断损伤模型基础上局部及鞘内给予BoNT/A重链;于用药后不同时间提取局部蛋白进行双向电泳,并根据双向电泳提示的蛋白点群变化的分子量和等电点,选取SCG10为目标蛋白行Western Blot检测及神经突起测定;通过抓力和热痛敏实验测试损伤侧后肢的运动和感觉功能情况。结果:(1)BoNT/A重链可干预脊髓损伤后局部蛋白谱的变化,MW位于18—25kDa、等电点在5—7范围的蛋白点可以作为蛋白点群变化的代表之一;(2)作为分子量位于18—25kDa/等电点在5—7的蛋白成分之一的SCG10在单纯损伤时较正常对照组其表达有所增高,给予BoNT/A重链后, SCG10的表达显著增强(P<0.05);(3)免疫荧光结果显示:单纯损伤时SCG10的阳性表达主要分布于损伤周边细胞的胞体,应用BoNT/A重链后,SCG10阳性分布于胞浆和细胞突起且以损伤近头端的周边区域较为显著;(4)突起测定结果显示:BoNT/A重链可促进脊髓损伤周边神经细胞突起增长,包括突起数目增多及含有突起的神经细胞百分比增多(P<0.05);(5)给予BoNT/A重链后,损伤侧后肢肌力明显优于单纯损伤组(P<0.05),但感觉功能未见明显改善。结论:脊髓损伤局部给予BoNT/A重链可促进生长相关蛋白SCG10的表达并促进损伤周边神经细胞突起生长,改善肌肉抓力。BoNT/A重链有助于脊髓损伤后的再生修复。

A型肉毒素重链干预对大鼠脊髓损伤后生长相关蛋白表达的影响

目的探讨人工重组A型肉毒素重链(Bo NT/A重链)对在体大鼠脊髓损伤局部生长相关蛋白表达的影响,为阐明Bo NT/A重链促神经突起再生机制提供依据。方法建立大鼠单侧腰段脊髓横断损伤模型并局部及鞘内给予Bo NT/A重链;对用药后不同时间局部骨髓组织进行双向电泳检测总体蛋白表达;选择生长相关蛋白-43(GAP-43)和颈上神经节蛋白10(SCG 10)进行蛋白印迹和免疫荧光检测以观察二者在Bo NT/A重链影响下的表达及分布。结果 (1)单侧腰髓离断损伤模型动物呈现明显单侧运动及感觉功能障碍;(2)脊髓损伤后给予Bo NT/A重链可影响损伤局部蛋白表达谱变化:Bo NT/A重链可引起损伤局部蛋白点群在变化的基础上逆转或表达进一步增加,尤以MW位于35~45 k Da及18~25 k Da、等电点在5~7范围的蛋白点表现明显;(3)蛋白印迹和免疫荧光染色结果提示:Bo NT/A重链可促进p-GAP 43和SCG 10的表达(P<0.05),且p-GAP 43及SCG 10主要以损伤周围细胞阳性明显,胞浆及突起皆呈阳性。结论脊髓损伤后给予Bo NT/A重链可促进脊髓损伤后选择性生长相关蛋白p-GAP 43和SCG 10的表达。

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A单克隆抗体的制备及其靶位点区域的鉴定

为制备非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(NMHC-II A)的单克隆抗体(MAb),本研究将编码NMHC-Ⅱ A羧基端1 651～1 960氨基酸的表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞Rosseta中诱导表达,重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG 4000介导融合。ELISA方法检测筛选阳性杂交瘤细胞,制备腹水并纯化MAb,以间接免疫荧光和免疫沉淀方法鉴定MAb的特异性,western blot检测MAb靶位点区域。结果表明,通过筛选得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系,其抗体亚型为IgG1,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶2 560和1∶1.0×106;该MAb能够特异性结合相应抗原,并结合Marc-145细胞;western blot结果显示该抗体与NMHC-Ⅱ A的1 812～1 894氨基酸位点结合。该抗体的制备为研究NMHC-Ⅱ A在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中的作用奠定了基础。

成纤维细胞生长因子受体3胞外配体结合区的重组表达及其与A型肉毒毒素重链C端的相互作用

目的:实现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)胞外配体结合区FGFR3D23的表达与纯化,并鉴定其与A型肉毒毒素重链C端(Bo NT/AHc)的相互作用。方法:全基因合成的FGFR3D23基因片段经酶切连入p TIG(+)质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达,获得的包含体经Ni2+柱纯化,透析复性后通过pull-down及ELISA检测纯化蛋白与Bo NT/AHc的相互作用。结果与结论:SDS-PAGE分析结果显示得到相对分子质量约27×103的蛋白特异表达条带,表达量为1.39 mg/L,包含体占73.4%;纯化和复性得到的目的蛋白纯度约96%,复性率约3%;pull-down及ELI-SA实验结果证明FGFR3D23可以与Bo NT/AHc特异性地相互作用。

免疫固定电泳分型技术在M蛋白相关疾病诊断中的应用

目的探讨免疫固定分型技术在M蛋白相关疾病诊断中的应用价值。方法采用免疫球蛋白定量、血清及尿蛋白电泳、血清及尿本周蛋白免疫固定电泳及其他试验,对2例患者标本进行检测和确认。结果结合实验室检测及患者临床体征,1例患者确诊为血清单克隆IgA-κ轻链型多发性骨髓,1例患者确诊为血清IgM-λ型巨球蛋白血症。结论随着电泳技术发展,免疫固定电泳分型技术在M蛋白鉴定中具有较高的特异性和敏感性,应加强其临床应用。

痉挛型瘫痪大鼠骨骼肌DNA甲基化水平与肌纤维构型

目的探讨骨骼肌在痉挛状态下对DNA甲基化水平的影响及与肌纤维构型的相关性。方法健康5日龄Wistar新生仔鼠100只,随机分为模型组和对照组。前者制备痉挛型瘫痪大鼠模型成功后饲养30 d。对两组大鼠腓肠肌进行肌肉活检。分别进行骨骼肌DNA甲基化水平测定、骨骼肌Ⅰ型肌球蛋白重链m RNA半定量RT-PCR检测,透射电镜观察。结果模型组骨骼肌总体DNA甲基化水平(4.95±0.83)×10%,显著低于对照组的(6.59±0.75)×10%(P<0.001);模型组骨骼肌Ⅰ型肌球蛋白重链m RNA表达量(1.23±0.31),显著高于对照组的(0.44±0.29)(P<0.001)。电镜观察,模型组骨骼肌Z线排列不规整,两旁骨骼肌线粒体增多,线粒体肿胀,线粒体嵴部分断裂;粗细肌丝数量关系失衡,肌原纤维包膜融合,有的包膜间隙增宽。结论痉挛型瘫痪大鼠骨骼肌DNA低甲基化,Ⅰ型肌球蛋白重链m RNA高表达;电镜检测以Ⅰ型纤维表现为主。没有充足证据表明骨骼肌DNA甲基化水平与肌纤维构型改变相关。

一种检测A型肉毒毒素的高灵敏度酶联免疫吸附法

目的:建立检测A型肉毒毒素的酶联免疫吸附法。方法:利用重组A型肉毒毒素重链羧基端片段作为免疫原和B淋巴细胞杂交瘤技术,获得了56株高亲和力的抗A型肉毒毒素单克隆抗体(mAb),建立了检测A型肉毒毒素的双mAb夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。结果:该方法理论检测下限达到了8.34 pg/mL,检测天然A型肉毒毒素制剂时其实际检测下限可达0.78 LD50/mL,与其他型别的肉毒毒素均未见交叉反应。通过测定基质中的回收率,发现基质中的相关的蛋白对检测具有较大的影响。结论:该方法具有灵敏度高,特异性好,使用方便等优点,具有较高的的实用价值。

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链B羧基端多肽单克隆抗体的制备及鉴定

为了得到能够特异性识别非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链B(NMHCⅡ-B)的单克隆抗体,根据Marc-145细胞上NMHCⅡ-B羧基端的蛋白质序列,合成多肽,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法筛选阳性克隆;制备腹水并纯化;用间接ELISA和间接免疫荧光试验检测纯化抗体的特异性。结果显示,获得2株能稳定传代并分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系;单克隆抗体的特异性鉴定显示,2株细胞系所产生的抗体能够特异性地与NMHCⅡ-B羧基端蛋白反应而且能与Marc-145细胞产生特异性的结合。这2株单抗的制备及鉴定为研究易感细胞上NMHCⅡ-B与猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的关系奠定了基础。

增龄骨骼肌萎缩及运动对其影响机理的实验研究

用组化方法与Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分子杂交技术分析测定了增龄鼠肌纤维横截面积（ＣＡＳ）与肌凝蛋白重链ⅡＢ型蛋白的基因表达和运动后上述两个指标的变化。结果显示：增龄鼠肌纤维横截面积减小，表现出肌萎缩的特征。同时，肌凝蛋白重链ⅡＢ型蛋白的基因表达水平下降。运动后肌纤维横截面积增大，同时肌凝蛋白重链ⅡＢ型蛋白的基因表达水平升高。提示增龄骨骼肌萎缩的发生与其增龄后肌纤维蛋白的基因表达水平下降使肌纤维蛋白合成能力下降，导致肌肉萎缩。运动可以提高肌纤维蛋白的基因表达水平，来增加肌纤维的蛋白合成能力，增大ＣＡＳ，从而减轻机体增龄或衰老后肌肉的萎缩程度。

多克隆丙种免疫球蛋白血症的实验室鉴定分析探讨

目的探讨多克隆丙种免疫球蛋白的临床诊断价值。方法采用免疫球蛋白定量、血尿蛋白电泳、血清及尿本周氏蛋白免疫固定电泳及其他试验,对患者标本进行同时检测确认。结果从1例类风湿性关节炎患者检出血清为IgG、IgM、IgA、KAP和LAM及尿液KAP和LAM同时显多克隆增殖的多克隆丙种免疫球蛋白血症。结论多克隆丙种免疫球蛋白血症往往出现在慢性炎症者有并发症时。

金雀异黄素对高糖培养肾小球系膜细胞SMemb表达及细胞外基质的影响

目的探讨金雀异黄素(Gen)对高糖培养下大鼠系膜细胞(MC)表型和细胞外基质(ECM)的影响。方法对照组:低糖DMEM培养液;实验组:高糖DMEM培养液(含0、5、10、50、100、200μmol/LGen),培养12、24、48h,分别检测SMemb mRNA、MMP-2 mRNA、TIMP-1 mRNA水平及上清液Fn的含量。结果Gen可抑制高糖刺激下SMemb的表达,减少Fn的分泌(P<0.01或0.05);并可增加MMP-2/TIMP-1 mRNA半定量比值,呈浓度、时间依赖性。结论在体外高糖条件下,Gen干预可降低MCSMemb表达,减轻ECM积聚。

人γ干扰素基因转染成肌细胞在治疗骨骼肌损伤中的应用

目的：构建转人γ干扰素（human interferonγ,hIFNγ）基因的成肌细胞,探讨hIFNγ对小鼠急性钝挫伤骨骼肌修复过程的影响。方法：①应用基因重组技术,将hIFNγ基因克隆到pEGFP-C2真核表达载体中,以酶切和测序方法鉴定重组质粒pEGFP-C2-hIFNγ的正确性;②经脂质体介导转染C2C12成肌细胞,用RT-PCR和Western Blot法检测转基因细胞的hIFNγ表达。③64只7-12周雄性C3H小鼠,制作右侧腓肠肌钝挫伤动物模型,随机分成4组,即A组（注射hIFNγ）,B组（注射转hIFNγ的C2C12细胞）,C组（注射空白成肌细胞）,D组（未干预）。挫伤后第10天,A、B、C组的小鼠,于腓肠肌损伤局部注射不同药物,D组不进行干预以作为自然愈合对照。分别于伤后7、14、28、42天,从各组中随机抽取4只小鼠进行右侧腓肠肌损伤部位取材,以荧光定量PCR和免疫荧光化学染色检测不同时间点波形蛋白（Vimentin）及Ⅱb型肌球蛋白重链（MHC-Ⅱb）的表达。结果：①酶切和测序结果均证实成功构建了hIFNγ真核表达质粒pEGFP-C2-hIFNγ,RT-PCR和Western Blot检测到转染细胞中hIFNγ基因的表达;②干预后各时间点,A、B组小鼠损伤骨骼肌Vimentin表达较C组和D组降低;伤后42天,B组损伤骨骼肌Vimentin表达低于A组,其余时间点A、B两组间无显著差异;③各组MHC-Ⅱb表达无明显差异。结论：①成功制备了含hIFNγ基因的真核表达质粒,转染后获得了高效表达hIFNγ的鼠C2C12成肌细胞;②采用转染hIFNγ的C2C12成肌细胞局部注射,可以抑制骨骼肌纤维化标志产物波形蛋白的表达,与注射外源性IFNγ的作用近似。③局部注射转hIFNγ基因的成肌细胞或外源性IFNγ,未发现对骨骼肌再生标志产物MHC-Ⅱb表达有明显影响。

猪NMMHC-ⅡA基因功能区的克隆及表达特征分析

为了解NMMHC-ⅡA是否与不同品种猪对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗性差异有关,本研究克隆了对PRRSV易感的三元杂交猪(杜大长)、抗PRRSV的我国优良地方品种莱芜猪和大蒲莲猪NMMHC-ⅡA基因中含PRRSV结合区(23个氨基酸)在内的羧基端954bp的cDNA序列,并分析了其在物种间的同源性和在不同品种间的差别,通过RT-PCR法检测了该基因在猪体内的表达特征。结果表明,NMMHC-ⅡA的cDNA序列在哺乳动物中的保守性较高,猪与人、大鼠、小鼠、牛、猴、狗等物种的核苷酸及氨基酸序列同源性均较高;莱芜猪、大蒲莲猪及杜大长杂交猪NMMHC-ⅡA蛋白羧基端的氨基酸序列完全相同,而NMMHC-ⅡA基因的核苷酸序列有3处不同。猪NMMHC-ⅡA基因在猪肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、淋巴结、扁桃体、大肠、小肠、胃和肌肉中均有明显的表达,而在心脏和大脑中有弱表达,在小脑及子宫中几乎检测不到其表达。结果显示,对蓝耳病呈现不同抗性的杜大长杂交猪和莱芜猪、大蒲莲猪NMMHC-ⅡA基因的功能区没有区别,该基因在除小脑和子宫外的多种组织中均表达,NMMHC-ⅡA与猪抗蓝耳病的关系需进一步研究。

微小RNA-499通过调节肌球蛋白重链基因轴改善脓毒症心功能障碍的研究

目的探讨微小RNA-499(miR-499)调节α型和β型肌球蛋白重链(α-MHC、β-MHC)基因轴在脓毒症心功能障碍(SMD)中的作用机制及意义。方法将60只健康成年雄性SD大鼠按随机数字法分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(PBS组)、脂多糖(LPS)致SMD模型组(LPS组)、miR-499激动剂预处理组(agomir+LPS组)和miR-499抑制剂预处理组(antagomir+LPS组),每组15只。采用腹腔注射LPS 10 mg/kg制备SMD大鼠模型;PBS组腹腔注射等量PBS。两个预处理组分别于制模前连续3 d经尾静脉注射agomir 30 mg/kg或antagomir 80 mg/kg,每日1次;PBS组和LPS组不给予预处理。注射LPS 5 h后检测超声心动图,并记录相关指标;在注射LPS 6 h后取左心房血和心肌组织,采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测血浆和心肌组织中miR-499的表达量;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测心肌组织中α-MHC、β-MHC的蛋白表达;采用电化学发光仪测定血浆心力衰竭标志物N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)水平。结果与PBS组比较,LPS刺激后大鼠出现精神萎靡,血浆和心肌组织中miR-499表达下调,且心肌组织中α-MHC表达显著下调、β-MHC表达显著上调,超声心动图结果显示左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)、心排血量(CO)、每搏量(SV)和心率(HR)分别下降了49.1%、59.2%、48.8%、39.4%、15.9%,且血浆NT-proBNP水平显著升高,表明LPS能诱导大鼠心功能障碍。与LPS组相比,给予agomir预处理过表达miR-499后,超声心动图显示大鼠心功能改善,表现为LVEF、LVFS显著升高〔LVEF:0.662±0.020比0.323±0.024,LVFS:(36.16±1.43)%比(20.20±1.32)%,均P<0.01〕;同时大鼠心肌组织中β-MHC/α-MHC失调被逆转,β-MHC蛋白表达显著下调(β-MHC/GAPDH:0.74±0.04比2.97±0.34,P<0.01),α-MHC的蛋白表达显著上调(α-MHC/GAPDH:1.59±0.05比0.74±0.14,P<0.01),且血浆NT-proBNP水平明显下降(ng/L:114.49±6.85比334.13±4.36,P<0.01)。而给予antagomir预处理抑制miR-499表达后,超声心动图显示大鼠心功能被显著抑制,表现为LVEF、LVFS较LPS组显著下降〔LVEF:0.297±0.021比0.323±0.024,LVFS:(19.38±1.52)%比(21.20±1.32)%,均P<0.01〕;同时大鼠心肌组织中α-MHC蛋白表达显著下调(α-MHC/GAPDH:0.63±0.03比0.74±0.14,P<0.01),β-MHC蛋白表达显著上调(β-MHC/GAPDH:3.03±0.47比2.97±0.34,P<0.01),且血浆NT-proBNP水平明显升高(ng/L:373.91±4.23比334.13±4.36,P<0.05)。结论miR-499能通过调节SMD大鼠心肌组织中α-MHC、β-MHC的表达水平,改善脓毒症引起的心功能障碍;靶向调节miR-499的表达可能成为治疗SMD的有效途径。