miR-29a靶基因ITGβ_1-3'UTR萤光素酶报告基因质粒的构建及对心肌成纤维细胞增殖的影响

目的:利用microRNA靶位点预测网站预测了miR-29靶基因及结合位点,构建含野生型及其突变型整合素β_1(integrinβ_1,ITGβ_1)-3'端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统(p MIR-ITGβ_1-3'UTR),通过转染细胞、双荧光素酶活性分析初步确定miR-29的靶位点,以此研究miR-29对ITGβ_1基因靶向调控的作用。方法:提取人全血RNA,逆转录mRNA成c DNA,以之为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增ITGβ_1-3'UTR片段,经酶切后连接至荧光素酶报告载体p MIR-Report上,构建出p MIR-ITGβ_1-3'UTR的荧光素酶报告基因载体及突变载体并进行鉴定。将p MIR-Report Luciferase载体,所构建的p MIR-ITGβ_1-3'UTR及突变载体分别同miR-29 mimics共转染至大鼠心肌成纤维细胞,采用双荧光素酶实验分析miR-29与ITGβ_1的作用机制。结果:通过酶切及基因测序的方法证实所构建质粒序列正确,克隆获得的DNA片段大小及序列与Genbank报道的一致;成功构建p MIR-ITGβ_1-3'UTR双荧光素酶报告基因,双荧光素酶实验证实miR-29可以结合在ITGβ_1-3'UTR相应的碱基位点,并显著下调荧光素酶的表达。结论:该荧光素酶报告基因载体构建成功,转染miR-29 mimics后能显著下调萤火虫荧光素酶的表达。