野生型p53基因与双脱水二乙酰卫矛醇联合诱导肝癌HLE细胞凋亡的研究

背景和目的:p53基因是抑癌基因,研究发现在人类肿瘤中p53基因常发生突变。实验证明野生型p53基因不但抑制肿瘤细胞增殖,而且诱导肿瘤细胞凋亡。但是,单独应用野生型p53基因诱导肿瘤细胞凋亡的作用不很明显。因此,野生型p53基因与药物的联合作用来提高肿瘤细胞凋亡率是目前对肿瘤研究的一新领域。本实验通过转染野生型p53基因联合双脱水二乙酰卫矛醇(1,2:5,6-dianhydro-3,4-diacetylgalactitol,DADAG)作用于肝癌细胞株HLE,研究联合诱导肿瘤细胞的凋亡作用。方法:野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞株HLE,同时加入DADAG。96h后,用流式细胞仪、DNA电泳方法进行细胞凋亡分析。结果:流式细胞仪分析细胞凋亡结果:阴性对照组为1.4%、转染pUHD10-3组为3.5%、DADAG处理组为32.6%、转染pUHD10-3-p53组为43.4%、转染p53基因及DADAG处理组为74.6%。DNA电泳发现,转染p53基因及DADAG处理组有到DNA梯形条带。结论:野生型p53基因与DADAG均可诱导人肝癌细胞HLE发生凋亡,转染野生型p53基因与DADAG联合作用,有促进肝癌细胞凋亡的作用。

野生型p53基因重组质粒的构建及其对人肠癌细胞的抑瘤效应

人p53基因是一种抑癌基因,p53蛋白作为一种细胞增殖的负调节因子,调控细胞的生长和分化,维持基因组DNA的稳定,其突变、缺失或与细胞、病毒、肿瘤蛋白结合所致的p53失功能,在恶性肿瘤发生发展中起着非常重要的作用.为了进一步探讨野生型p53基因的抗肿瘤特性,我们采用分子克隆方法将人野生型p53基因(WT-p53)cDNA全长正向插入到哺乳动物表达载体(pREP9)的BamHl位点,构建了pREP9-p53重组体,用电穿孔方法将其导入有p53基因突变的人肠癌SW1116细胞,通过标记基因Neo^R筛选带外源p53基因的G418抗药性克隆,以观察抗药性克隆数量,同时对G418抗药性细胞的生长速度及细胞增殖周期进行观察.结果表明,导入WT-p53基因能使肠癌SW1116细胞的G418抗药性克隆形成减少,细胞生长速度较对照细胞明显减慢,细胞增殖周期GI期增加、S期下降.这些结果证明人野生型p53基因能抑制肠癌细胞的生长.本研究为大肠癌WT-p53实验性基因治疗提供了理论依据,说明基于恢复P53肿瘤抑制基因功能的基因治疗在治疗结、直肠癌方面有着广阔的应用前景.

野生型p53基因在人肝癌细胞的表达及诱导其凋亡

目的:探讨外源性野生型p53基因(wt-p53)对人源性肝癌细胞系生物学的影响。方法:用脂质体转染法将真核表达质粒p53-pcDNA3转染人源性肝癌细胞系HepG2中,用G418筛选细胞;用生物素标记p53的cDNA探针,通过RNA原位杂交方法,检测p53-pcDNA3在细胞中的表达;用流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡指数。结果:G418筛选出了阳性转染细胞;RNA原位杂交显示HepG2的胞质成棕黄色,证明了p53的表达;FCM检测表明,转染p53-pcDNA3的HepG2细胞,其增殖能力下降,细胞凋亡指数由转染前的10.03%上升为54.17%。结论:外源性wt-p53可通过脂质体转染法在HepG2细胞中成功表达,并诱导其发生凋亡,有较好的临床应用前景。

野生型p53基因转移对血管内膜损伤后再狭窄的防治作用

为防止血管成形术后管腔再狭窄，我们构建了介导野生型ｐ５３基因转移的复制缺陷型重组腺病毒（Ａｄ－ｐ５３），将Ａｄ－ｐ５３感染日本大耳兔球囊损伤后的髂动脉，并通过携带ＬａｃＺ基因重组腺病毒感染观察基因转染效率。结果可见Ａｄ－ｌａｃＺ感染损伤后的动脉３天后血管内膜、中膜、外膜均有ＬａｃＺ基因的阳性表达；Ａｄ－ｐ５３感染损伤后的髂动脉２周后可见血管内膜增厚程度、内膜与中膜的比例明显减小，管腔狭窄程度明显减轻，ｐ５３蛋白大量表达，与对照组相比具有显著差异。证明野生型ｐ５３基因转移能明显抑制血管损伤后的内膜增殖，为野生型ｐ５３基因转移防治血管内膜损伤后再狭窄奠定了实验基础。

HCMV的IE2介导野生型p53基因促凋亡作用的研究

选择野生型P5 3缺失型的Jurkat细胞系 ,首先将wt p5 3 pLXSN稳定转染入Jurkat细胞 (Jurkat wt p5 3) ,再分别或联合转染IE1、IE2基因 ,并利用流式细胞仪分析。结果显示 ,转染了IE2基因的Jurkat wt p5 3细胞在瞬时转染 2 4h后出现光镜下可见的细胞凋亡改变 ,此时取样进行流式细胞仪测定细胞周期分布状况 ,可见转染了IE2基因的Jurkat wt p5 3细胞周期分布较其他各组发生了明显的变化 ,G1期和S期细胞分布减少 ,而G2 期细胞增多 ,细胞阻滞于G2 /M期 ,并且出现了细胞凋亡亚二倍体峰 ,引起细胞凋亡。研究表明 ,在Jurkat细胞中HCMV的IE2基因可介导野生型p5 3基因的促凋亡作用。

野生型p53基因转移抑制兔心肌细胞生长的实验研究

目的 探讨野生型 p5 3基因转移对兔心肌细胞生长的抑制作用及 p5 3基因用于心肌肥厚基因治疗的可能性。方法 将腺病毒介导的野生型 p5 3基因转入体外培养的乳兔心肌细胞 ,应用生化染色方法、Westernblot杂交检测野生型 p5 3基因的转染效率及表达结果 ,采用透射电镜、MTT增殖抑制实验 (MTT)及流式细胞仪细胞周期分析方法研究野生型 p5 3基因对细胞生长的抑制作用。结果 重组腺病毒能有效地将野生型 p5 3基因转入心肌细胞中 ,并且检测到 p5 3基因表达 ;转入的 p5 3基因导致心肌细胞收缩、体积变小 ;MTT结果显示 ,野生型 p5 3基因能够抑制心肌细胞生长 ,且生长抑制率呈现时间和剂量依赖性 ;心肌细胞增殖周期结果显示 ,细胞G0 - G1 期 DNA百分含量明显高于对照组 ,提示发生 G1 期阻滞。结论 野生型 p5 3基因能高效转染体外培养的心肌细胞 ,对心肌细胞生长有明显的抑制作用 ,其抑制作用的机理是由于野生型 p5 3基因影响心肌细胞的增殖周期 ,以上结果为心肌肥厚的基因治疗提供了重要的实验依据。

外源野生型p53基因表达对人肺癌细胞药物敏感性影响

目的 了解外源野生型p5 3(wild typep5 3 ,wtp5 3)基因表达对人大细胞肺癌 80 1 D细胞对化疗药物敏感性的影响。方法 选用p5 3基因突变的人大细胞肺癌 80 1 D系。用脂质体介导构建的含wtp5 3基因载体转染 80 1 D细胞 ,PCR检测外源wtp5 3在宿主细胞存在情况 ,3H TdR掺入法测定 80 1 D细胞转染wtp5 3后药物敏感性变化 ,流式细胞仪 (FACS)分析细胞死亡情况。结果 转染wtp5 3在 80 1 D细胞有效表达 ,FACS分析转染细胞死亡率为 2 0 .1%。对多种抗癌药物筛选 ,转染wtp5 3细胞对顺铂和5 氟脲嘧啶敏感性分别提高 9.7和 11.4倍 ,对非DNA损伤制剂和其它DNA损伤制剂的敏感性无变化 ;DNA断裂电泳分析和形态学观察显示细胞呈坏死特征。结论 wtp5 3可选择性增加 80 1 D细胞对某些DNA损伤制剂的敏感性 ,其调节机制可能以非凋亡途径为主 。

肺腺癌高、低转移细胞系Anip973、AGZY83-a中野生型p53基因过表达研究

目的探讨野生型ｐ５３基因及其表达产物ｐ５３蛋白在恶性肿瘤基因治疗中的作用。方法应用腺病毒为载体将野生型ｐ５３基因转入高、低转移的肺癌细胞系Ａｎｉｐ９７３、ＡＧＺＹ８３－ａ，并且对各组转染细胞进行生长曲线、原位末端标记、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ等技术检测分析。结果野生型ｐ５３蛋白的过表达对上述肺腺癌细胞系均呈现出较强的生长抑制作用，野生型ｐ５３蛋白的过表达对高转移肺癌细胞系Ａｎｉｐ９７３的抑制作用明显高于低转移细胞系ＡＧＺＹ８３－ａ。结论外源性野生型ｐ５３基因的过表达，可以有效抑制上述肿瘤细胞的增殖，同时对高转移肺腺癌细胞系的抑制作用更加显著。

野生型p53基因对胰腺癌细胞的抑制作用

目的 观察人类野生型p5 3 (wtp5 3 )基因对人胰腺癌细胞系的抑制作用。方法 用逆转录病毒为载体将外源性wtp5 3基因导入人胰腺癌细胞系PC -2 ,通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用。结果 p5 3在转染细胞PC -2 /p5 3中表达水平提高。外源性wtp5 3基因的导入和表达能使PC -2细胞的生长速率减低 ,软琼脂集落形成能力下降 ,G0 +G1期细胞比例增加 ,凋亡指数升高 ,裸鼠体内成瘤能力明显下降。结论 逆转录病毒载体介导的外源性野生型p5

野生型p53基因调控膀胱移行细胞癌中心体异常的实验研究

目的研究野生型p53基因抑制膀胱癌细胞中心体异常的作用。方法将野生型p53基因重组腺病毒载体转染人膀胱癌细胞T24,应用免疫荧光化学法检测膀胱癌细胞中心体异常变化情况。结果野生型p53基因可抑制膀胱移行细胞癌T24细胞中心体异常。结论p53基因可能是膀胱移行细胞癌中心体异常的一个重要调控因子,p53基因失活可能引起肿瘤细胞染色体不稳,从而促进肿瘤的发生和发展。

野生型p53基因抑制人结肠癌细胞的体内抑瘤效应观察

目的研究人野生型p53基因对人结肠癌SW1116细胞生长的影响。方法采用电穿孔法将正向携带有野生型p53基因cDNA的重组反转录病毒质粒导入有p53基因突变的人结肠腺癌SW1116细胞,筛选带外源p53基因的G418抗药性SW1116细胞克隆,对其进行生长速度、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤等方面的检测,分析其生物学特性变化。结果导入人野生型p53基因使人结肠腺癌SW1116细胞的生长速度明显减慢(P<0.05或0.01)、软琼脂集落数量明显较对照组减少(P<0.05或0.01),移植瘤体积较对照组明显小(P<0.05)。结论人野生型p53基因对人结肠腺癌SW1116细胞有明确的抑瘤效应。

野生型P53基因转染对肝肿瘤细胞系的影响

随着肿瘤发生的分子机制研究取得重要进展，肿瘤的治疗技术除外科手术、放疗、化疗以及生物治疗外，人们目前正寻求一种新的治疗方法——基因治疗。P53基因是当今研究的热点之一，它与人类许多肿瘤的发生发展有关。野生型P53基因是显性基因，单拷贝基因的表达就可抑制肿瘤的生长，因此，将野生型P53基因导入肿瘤细胞，

二乙酰去水卫矛醇联合野生型p53基因诱导肝癌BEL-7404细胞凋亡的作用

目的 实验通过转染野生型p53基因与应用二乙酰去水卫矛醇(1，2：5，6-Dianhydro-3，4-diacetylgalactitol，DADAG)联合作用于肝癌BEL-7404细胞，来研究p53基因联合二乙酰去水卫矛醇诱导肝癌BEL-7404细胞的凋亡作用。方法野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌BEL-7404细胞，同时加入DADAG作用。96h后，用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为1．6％、转染pUHD10-3组为3．9％、用DADAG处理组为29.4％、转染pUHD10-3-p53组为35.3％、转染p53基因及用DADAG处理组为59．8％。结论野生型p53基因与DADAG均可诱导人肝癌BEL-7404细胞发生凋亡，转染野生型p53基因与DADAG联合作用，有促进肝癌BEL-7404细胞凋亡的作用。

脉冲电场联合野生型p53基因诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡

背景:在前期研究基础上,设想将基因电转染作为脉冲电场治疗恶性肿瘤的辅助方法。目的:探讨脉冲电场联合抑癌基因野生型p53基因诱导人宫颈癌hela细胞发生凋亡及相互作用。方法:采用空质粒及含有野生型p53的质粒转染Hela细胞得到Hela-vector、Hela-p53细胞,将Hela细胞、Hela-vector和Hela-p53细胞分别施加固定脉宽100μs、频率1Hz、脉冲数8个、电场强度为1500V/cm的脉冲电场处理。结果与结论:相同参数脉冲电场作用于各组细胞12h后,MTT结果显示Hela-p53组细胞吸光度明显低于Hela组(P<0.05);流式细胞仪及RT-PCR检测结果显示Hela-p53组的早期凋亡率和p53mRNA表达较Hela组明显增加;Westernbolt及激光共聚焦显微镜结果显示与Hela组比较,Hela-p53组细胞Bax蛋白表达明显上升,而Bcl-2蛋白则明显下降,Casepase-3相对荧光强度明显增强。表明野生型p53基因对宫颈癌Hela细胞生长有明显的抑制作用,野生型p53基因可以提高脉冲电场诱导宫颈癌Hela细胞凋亡的作用。

野生型p53基因转移对心肌细胞形态的影响

目的 :探讨腺病毒介导的野生型 p5 3基因转移对心肌细胞形态的影响及 p5 3基因用于心肌疾病基因治疗的可能性。方法 :将腺病毒介导的野生型 p5 3基因转入体外培养的乳兔心肌细胞 ,应用生化染色方法、Western blotting技术检测野生型 p5 3基因的转染效率及其表达效果 ,采用相差显微镜、透射电镜等实验方法观察心肌细胞的形态学改变。结果 :重组腺病毒载体有效地将 p5 3基因转入心肌细胞中并使其得以表达 ;转入的 p5 3基因可以导致心肌细胞收缩、体积变小、胞浆浓缩、核固缩、染色质边集等改变。结论 :野生型 p5 3基因转移可以影响心肌细胞的形态 。

人野生型p53基因增强5-FU对大肠癌化疗敏感性的分子生物学机制

为了探讨人野生型p53(wt-p53)基因增强大肠癌细胞化疗敏感性的分子生物学机制,将携带wt-p53基因的质粒分别转染两种p53基因突变的人大肠癌细胞系HT-29及SW620,分析细胞中p53及细胞周期蛋白D1(cyclinD1)蛋白的表达水平;将化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)以不同浓度、不同时间分别作用于HT-29及SW620细胞,另外将已转染wt-p53基因的大肠癌细胞用5-FU进行诱导,Western印迹分析上述干预条件下细胞中p53蛋白及细胞周期蛋白D1表达水平的变化;流式细胞术检测wt-p53基因联合5-FU组及对照组中细胞凋亡的改变情况.结果表明,wt-p53基因能增加癌细胞中细胞周期蛋白D1的表达,与wt-p53基因呈剂量依赖性关系;5-FU则降低其蛋白表达,与5-FU呈时间和剂量依赖性关系,而5-FU所致的细胞周期蛋白D1表达水平的降低在细胞预先转染了wt-p53基因时会被抑制;wt-p53基因与5-FU联合使用能提高大肠癌细胞凋亡率.结果提示,wt-p53基因可提高大肠癌细胞中细胞周期蛋白D1的表达水平,并抑制5-FU所致的细胞周期蛋白D1降解,从而提高大肠癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性.

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞株端粒酶活性的影响

目的 :探讨野生型 p5 3(wt- p5 3)基因转染对卵巢癌细胞端粒酶活性的影响。方法 :利用脂质体介导 ,将含有人全长 wt- p5 3基因 c DNA的真核表达载体质粒 p CEP4 / p5 3和空载体质粒 p CEP4分别转染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌 SKOV3细胞株 ,分别命名为 SKOV3- p CEP4 / p5 3细胞 (C组 )、SKOV3- p CEP4细胞 (B组 ) ,另设 SKOV3细胞为空白对照组 (A组 ) ,观察 3组细胞周期和端粒酶活性变化。结果 :外源性 wt- p5 3基因在 C组细胞中获表达 ,而 A、B组细胞中无 wt- p5 3基因的表达。流式细胞仪检测示 C组细胞 G0 ～ G1 期百分比 (5 7.79% )及凋亡细胞率 (13.91% )均高于 B组 (46 .0 2 %、2 .0 8% )和 A组 (43.6 2 %、0 ) ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ,A、B、C3组细胞中端粒酶活性均呈阳性 ,但 3组细胞端粒酶活性无显著性差异 (P =0 .6 5 )。结论 :wt- P5 3基因转染可介导 SKOV3细胞 G0 ～ G1 期停滞和诱导细胞凋亡 ,但对

野生型p53基因转移对心肌细胞生长的抑制作用

为了探讨野生型ｐ５３ 基因对心肌细胞生长的抑制作用及应用于高血压和肥厚型心肌病等疾病所致心肌肥厚的基因治疗可能性，本实验将野生型ｐ５３ 基因重组腺病毒转染体外培养的乳兔心肌细胞。应用生化染色方法、免疫组化法及聚合酶链反应技术，检测了野生型ｐ５３ 基因的转染效率及表达效果。采用ＭＴＴ方法及光镜技术进一步观察了野生型ｐ５３ 基因对心肌细胞生长的调节作用。结果显示，腺病毒载体能有效地将外源基因导入心肌细胞中并使其得以表达，导入的野生型ｐ５３ 基因能够抑制心肌细胞生长，且生长抑制率呈时间和剂量依赖性。以上结果为进一步研究心肌肥厚的基因治疗提供了重要依据。