野生型p53基因转染对人HCC-9204细胞端粒酶活性影响

目的 :探讨肿瘤抑制基因 p5 3对人肝癌细胞端粒酶活性及其催化亚单位hTERT (humantelomerasereversetranscriptase)的影响 ,并探讨可能的机制。方法 :用脂质体介导基因转染法将野生型p5 3(wt p5 3)导入端粒酶 /hTERTmRNA阳性、内源性 p5 3突变的HCC 92 0 4人肝癌细胞中 ;用Westernblot鉴定转染效率 ;PCR ELISA、TRAP 银染、原位杂交和RT PCR法检测细胞端粒酶活性和hTERTmRNA表达 ;用流式细胞仪观察细胞凋亡改变。结果 :外源wt p5 3基因转染后HCC 92 0 4细胞端粒酶活性明显受抑 ,hTERTmRNA表达水平下调 ,bcl 2表达减少 ,细胞呈现凋亡改变。结论 :外源wt p5 3基因表达可抑制人肝癌细胞端粒酶活性 ;端粒酶活化、hTERTmRNA表达存在 p5 3依赖性调节途径。

野生型p53基因转染对宫颈癌HeLa细胞生长及药物敏感性的影响

目的 探讨转染外源野生型 p5 3基因对宫颈癌 He L a细胞生长的抑制作用 ,并了解 p5 3基因与He L a细胞对顺铂敏感性之间的关系。方法 利用脂质体介导 ,将含人野生型 p5 3c DNA的 p CB6 .p5 3质粒导入人宫颈癌 He L a细胞株中 ,筛选阳性克隆 ,用免疫组化 ABC法检测 p5 3基因的表达情况。加入顺铂 72小时后 ,用四唑盐比色试验检测存活的 He L a细胞数。结果 在 G418选择培养基中培养两周后 ,成功地生长出阳性细胞克隆。免疫组化法证实外源性 p5 3基因在瘤细胞中稳定存在并传给子代 ,p5 3基因转染对 He L a细胞的生长有明显的抑制作用。p5 3表达阳性的 He L a细胞对顺铂的敏感性明显增强。结论 野生型 p5 3基因转染能使 He L

野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系A549 VEGF表达和肿瘤生长的影响

目的 :研究外源性野生型p5 3(wtp5 3)基因对人肺腺癌细胞系A5 4 9血管内皮生长因子 (VEGF)表达的影响 .方法 :将含有wtp5 3基因的 pcDNA3.1 wtp5 3和空载体 pcDNA3.1 neo质粒 ,通过阳离子脂质体转染A5 4 9细胞 ,应用半定量RT PCR和ELISA技术检测其对VEGF表达情况的影响 ;将A5 4 9,A5 4 9/ pcDNA3.1 neo和A5 4 9/ pcDNA3.1 wtp5 3细胞分别接种至裸鼠皮下 ,观察成瘤时间及瘤块大小 ;免疫组化法计数VEGF阳性细胞百分数并进行半定量分级 .结果 :pcDNA3.1 wtp5 3转染组VEGFmRNA和蛋白表达均明显低于其他 2组 .pcDNA3.1 wtp5 3转染后裸鼠成瘤时间延长 ,瘤块生长缓慢 .结论 :wtp5

野生型p53基因转染对人胃癌细胞的作用

目的评价外源性p53基因对人胃癌细胞生物学行为的影响。方法以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将人野生型p53基因导入不同p53状态的3种人胃癌细胞系,用免疫组化法检测p53基因在胃癌细胞中的表达;用流式细胞计数、细胞DNA片段化分析检测细胞周期分布和凋亡。结果在高MOI病毒剂量下,外源p53基因在3种胃癌细胞的胞核中均高效表达,并可使细胞产生明显的G2／M阻滞和凋亡,而且这种作用不依赖细胞内在的p53基因状态。结论无论体外还是体内实验,野生型p53基因转染胃癌细胞后均有明显的生物效应。该实验为进一步开展p53基因治疗的临床研究提供了理论依据。

野生型P53基因转染对肝肿瘤细胞系的影响

随着肿瘤发生的分子机制研究取得重要进展，肿瘤的治疗技术除外科手术、放疗、化疗以及生物治疗外，人们目前正寻求一种新的治疗方法——基因治疗。P53基因是当今研究的热点之一，它与人类许多肿瘤的发生发展有关。野生型P53基因是显性基因，单拷贝基因的表达就可抑制肿瘤的生长，因此，将野生型P53基因导入肿瘤细胞，

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞株端粒酶活性的影响

目的 :探讨野生型 p5 3(wt- p5 3)基因转染对卵巢癌细胞端粒酶活性的影响。方法 :利用脂质体介导 ,将含有人全长 wt- p5 3基因 c DNA的真核表达载体质粒 p CEP4 / p5 3和空载体质粒 p CEP4分别转染人卵巢浆液性乳头状囊腺癌 SKOV3细胞株 ,分别命名为 SKOV3- p CEP4 / p5 3细胞 (C组 )、SKOV3- p CEP4细胞 (B组 ) ,另设 SKOV3细胞为空白对照组 (A组 ) ,观察 3组细胞周期和端粒酶活性变化。结果 :外源性 wt- p5 3基因在 C组细胞中获表达 ,而 A、B组细胞中无 wt- p5 3基因的表达。流式细胞仪检测示 C组细胞 G0 ～ G1 期百分比 (5 7.79% )及凋亡细胞率 (13.91% )均高于 B组 (46 .0 2 %、2 .0 8% )和 A组 (43.6 2 %、0 ) ,差异有显著性 (P <0 .0 1) ,A、B、C3组细胞中端粒酶活性均呈阳性 ,但 3组细胞端粒酶活性无显著性差异 (P =0 .6 5 )。结论 :wt- P5 3基因转染可介导 SKOV3细胞 G0 ～ G1 期停滞和诱导细胞凋亡 ,但对

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验模型的建立

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，为进一步研究野生型ｐ５３蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡提供体外实验模型。方法：用ＤＮＡ转染技术将ＰＭ４７质粒，它是一种含激素诱导启动的鼠乳腺肿瘤病毒启动子和生化选择标志基因Ｅｃｏｇｐｔ的重组野生型ｐ５３ｃＤＮＡ质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２中，用ｇｐｔ选择培养基筛选阳性细胞克隆。结果：成功地将外源性野生型ｐ５３ｃＤＮＡ重组质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２细胞中，在ｇｐｔ选择培养基中培养２周后生长出阳性细胞克隆，命名为ＯＳ－７３２－Ｐ。结论：利用基因转染技术能将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中。

野生型p53基因转染对人胃癌细胞系HGC27生长的抑制作用

目的 研究野生型p5 3基因对人未分化胃癌细胞系HGC2 7生长的抑制作用。方法 用表达人野生型p5 3基因全长cDNA的真核载体pcDNA3 p5 3,转染人未分化胃癌细胞系HGC2 7,对转染后细胞进行生长曲线、细胞生长抑制率及流式细胞术分析 ,观察其生物学特性变化。结果 外源野生型p5 3基因在HGC2 7细胞内稳定表达 ,经pcDNA3 p5 3转染的HGC2 7细胞生长速度受到明显抑制 ,流式细胞分析显示G1期增加 ,S期下降 ,细胞出现凋亡。结论 野生型p5 3基因能在HGC2 7细胞内表达 。

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞生长及药物敏感性影响

目的 :探讨野生型p53基因转染对人卵巢癌细胞株SK0V 3的体外生长及裸鼠体内致瘤性抑制作用 ,并了解 p53基因与SKOV 3细胞对顺铂敏感性之间的关系。方法 :利用脂质体介导 ,将含有人野生型p53cDNA的真核表达质粒pCB6 p53导入SKOV 3细胞中 ,观察该细胞体外生长和裸鼠体内致瘤性改变 ;应用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况 ,MTT法检测细胞药物敏感性改变。结果 :免疫组化法证实外源性 p53基因在阳性细胞克隆稳定存在 ;转染野生型p53基因的SKOV 3细胞体外生长速率下降 ,裸鼠体内致瘤性丧失 ;G1/G0 期细胞百分比(81.5%)和凋亡细胞百分比(11 %)增高 ;p53表达阳性的SKOV 3细胞对顺铂的敏感性明显增强。结论 :野生型p53基因转染能使SKOV 3细胞出现生长抑制和对顺铂的化疗敏感性增强。

野生型p53基因转染卵巢癌SKOV-3细胞对化疗药物顺铂敏感性的影响

目的 研究野生型 p5 3基因转染卵巢癌 SKOV- 3细胞对化疗药物顺铂敏感性的影响。方法用脂质体介导的转染技术 ,将含有全长人野生型 p5 3c DNA的真核表达重组质粒分别导入受不同浓度顺铂作用的 SKOV- 3培养细胞中 ,观察 p5 3不同状态下对肿瘤细胞化疗敏感性的差异。结果 转染 p5 3基因后的 SKOV- 3细胞集落形成率与未转染的 SKOV- 3细胞相比 ,抑制率为 5 6 .4%。用 0 .5 μg/ml顺铂分别作用 2 4h、48h后 ,集落形成数分别下降了 76 .2 %、84.1% ;用 1μg/ml顺铂分别作用 2 4h、48h后 ,集落形成数分别下降了 89.5 %、93.7%。转染 p5 3基因后 ,肿瘤细胞 S期和 G2 /M期的比例下降 ,G1 /G0 期的比例增加 ,p5 3基因的转染使卵巢癌细胞发生 G1 期阻滞。结论 外源性野生型 p5 3基因的转染增加了卵巢癌SKOV- 3细胞对化疗药顺铂的敏感性。

外源性人野生型p53基因转染导致兔动脉硬化斑块的不稳定性

目的 建立动脉粥样硬化不稳定性斑块的动物模型。方法 6 4只雄性纯种新西兰大白兔随机分成A组 (5 4只 )与B组 (1 0只 ) ,A组用球囊损伤腹主动脉 +高脂喂养 1 0周 ,B组仅给予高脂喂养 1 0周。于 8周末将A组随机分为A1和A2两个亚组 ,在腹主动脉斑块形成处分别转染携带人野生型 p5 3基因或LacZ基因的重组腺病毒载体 ,2周后A1 (p5 3基因 )和A2 (LacZ基因 )组各处死1 0只 ,观察斑块自发破裂情况。分别给予余下的兔中国斑点蝰蛇毒 (CRVV)和组胺药物触发斑块破裂 ,然后将兔处死取出腹主动脉进行病理学及免疫组化检查。实验开始及处死前进行血脂检查。结果 A1组转染 p5 3阳性细胞数比其他两组明显增加 (分别为 32 4 %± 1 0 2 %,1 5 8%± 3 6 %,1 6 2 %± 6 7%,P均 <0 0 0 1 ) ,细胞凋亡率明显高于其他两组 (分别为 2 5 %± 0 8%,1 0 %±0 3%,0 9%± 0 4 %,P均 <0 0 1 ) ,斑块纤维帽显著变薄 (P <0 0 5 ) ,血管平滑肌细胞减少 ,巨噬细胞聚集 ,药物触发后有 1 2只共 2 0处发生斑块破裂及血栓形成 ,A2组中 ,药物触发后仅 5只 7处发生斑块破裂。B组未见斑块破裂及血栓形成。结论 应用外源性人野生型p5 3基因转染动脉硬化兔可导致斑块的不稳定性 。

转染野生型p53基因诱发家兔动脉粥样硬化斑块不稳定性的实验研究

目的探讨野生型p53基因对血管平滑肌细胞(VSMC)的促凋亡作用在构建动脉粥样硬化(As)不稳定斑块动物模型中的价值。方法54只雄性新西兰纯种兔用球囊损伤腹主动脉+高脂喂养10周,于8周末随机分成A组(p53基因组,27只)和B组(LacZ基因组,27只),在腹主动脉斑块形成处分别转染携带野生型p53基因或LacZ基因的重组腺病毒载体;2周后,A组和B组各处死10只,观察斑块的自发破裂情况。然后两组剩余实验兔给予中国斑点蝰蛇毒(CRVV)和组胺药物触发,比较两组发生斑块破裂的发生率。应用免疫组织化学染色、流式细胞仪、原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)及电镜检测基因转染部位的平滑肌细胞的凋亡情况。结果A组TUNEL测定的凋亡阳性细胞率显著高于B组(分别为2.5%±0.8%,1.0%±0.3%,P<0.05),流式细胞仪测定的细胞凋亡率亦明显高于B组(分别为20.04%±6.20%,6.89%±1.20%,P<0.01);电镜结果显示胞核中异染色体边聚明显,凋亡小体多见;斑块中的VSMC显著减少,纤维帽变薄以及纤维帽/内中膜厚度明显少于B组(纤维帽厚度分别为132.9±56.7,181.8±59.7,P<0.05;纤维帽/内中膜厚度0.20±0.18,0.21±0.11,P<0.05),药物触发后斑块破裂的发生率显著高于B组(分别为85.7%,23.1%,P<0.01)。结论外源性人野生型p53基因转染As家?

转染野生型p53基因稳定表达后早期肝癌细胞的自发性凋亡

目的：研究外源性野生型ｐ５３基因（ｗｔ－ｐ５３）对ＨＣＣ－９２０４肝癌细胞系的作用和意义。方法：通过脂质体介导方式将人ｗｔ－ｐ５３基因转染至肝癌细胞中。结果：转染ｗｔ－ｐ５３稳定表达早期，肝癌细胞发生自发凋亡，流式细胞仪检测结果显示典型的凋亡峰，其凋亡细胞数为５２．８％，细胞周期分析结果显示，转染ｗｔ－ｐ５３细胞中Ｇ１、Ｓ和Ｇ２期细胞分别为７９．１％，２０．５％和０．４％，亲本细胞则分别为４８．５％，２７．０％和２３．７％。琼脂糖电泳显示ＤＮＡ断裂呈梯状，透射电镜观察肝癌细胞发生染色质浓聚并边集。结论：转染的外源性ｗｔ－ｐ５３具有介导肝癌细胞凋亡的作用。

人肺癌细胞转染野生型P^(53)基因对生长的影响

研究转染野生型 P5 3基因对人肺癌细胞的生长影响作用。方法 :将带有野生型 P5 3基因的 p CEP4质粒 ,通过 L ipo-fectin转染肺癌细胞 ,用四甲基偶氮唑 (MTT)法观察细胞的生长情况。结果 :转染野生型 P5 3 基因 ,可使肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌细胞的生长明显受到抑制。结论 :野生型 P5 3基因有效抑制肺癌细胞的生长 ,可作为肺癌基因治疗的一种手段。

野生型p53基因转染卵巢癌SKOV-3细胞对放疗敏感性的影响

目的 研究野生型p5 3基因转染卵巢癌SKOV 3细胞对放疗敏感性的影响。方法 用脂质体介导的转染技术 ,将人野生型p5 3cDNA的真核表达重组质粒分别导入受不同剂量射线照射的SKOV 3培养细胞中 ,观察p5 3不同状态下对肿瘤细胞放疗敏感性的差异。结果 SKOV 3、SKOV 3 vect及SKOV 3 p5 3经 2Gy照射后 ,其集落形成数分别下降了 18 6 %、2 2 9%及 44 5 %;经 4Gy照射后 ,其集落形成数分别下降了 6 3 6 %、6 4 9%及 88 9%。转染p5 3基因后 ,肿瘤细胞S期和G2 M期的比例下降 ,G1 G0 期的比例增加 ,p5 3基因的转染使卵巢癌细胞发生G1 期阻滞。结论 外源性野生型p5 3基因的转染 ,增加了卵巢癌SKOV 3细胞对放疗的敏感性。

转染野生型p53基因对人肺腺癌细胞作用的研究

目的 研究外源性野生型 p5 3基因对人肺腺癌细胞系GLC 82的生物学作用。 方法 将含有野生型 p5 3基因的pDOR neo逆转录病毒载体 ,通过Lipofectin转染GLC 82细胞 ,采用流式细胞分析、电镜下观察、3 H TdR掺入试验、软琼脂培养集落形成率测试及裸小鼠成瘤性实验 ,观察野生型p5 3基因对GLC 82细胞的生物学效应。结果 电镜下观察可见 ,转染野生型p5 3基因可使GLC 82细胞出现一些病理现象 ,如细胞质中有明显的空泡及线粒体肿胀 ;流式细胞仪分析结果显示 ,野生型 p5 3基因可阻止GLC 82细胞周期停止于G1 S区域 ;3 H TdR掺入试验结果提示野生型 p5 3基因能够抑制GLC 82细胞的DNA合成 ,软琼脂培养集落形成率减少及裸小鼠成瘤减慢。结论 转染野生型p5 3基因可抑制GLC 82细胞恶性增殖。

新型阳离子聚合物非病毒载体介导野生型p53基因体外转染效果的研究

目的:研究新型阳离子聚合物非病毒载体———尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因体外转染人肝癌细胞系HepG2的效果。方法:载体UAC包裹含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因和wt-p53治疗基因的质粒(pEGFP-p53)转染HepG2细胞,利用流式细胞术和荧光显微术检测细胞内GFP的表达,优选最佳转染条件;采用RT-PCR法检测细胞内p53mRNA的表达,流式细胞术评价基因转染对细胞周期的影响,Western blot法检测细胞内p53及其下游细胞周期调控蛋白的表达。结果:在低pH(pH=6.9)条件下,采用低壳聚糖分子量(20000)的UAC作为载体,与pEGFP-p53形成高N/P(N/P=30)的UAC/pEGFP-p53复合物转染HepG2细胞,可获得最佳转染效果;载体UAC介导wt-p53基因转染细胞后,p53mRNA表达水平明显上调,G0/G1期出现显著阻滞,p53、p21和Rb蛋白表达水平明显上调,cyclin D1和CDK4蛋白表达水平明显下调。结论:载体UAC可成功介导wt-p53基因转染HepG2细胞,并诱导其产生细胞周期阻滞。

转染野生型p53基因介导的HL-60细胞凋亡与p21蛋白表达的关系

目的 :探讨野生型p5 3基因对HL - 6 0细胞的作用机制 ,并检测p2 1的表达 ,探讨二者在白血病中的关系。方法 :用脂质体介导的方法将野生型p5 3基因导入p5 3基因严重缺失的人髓细胞白血病细胞系HL - 6 0中 ,用形态学 ,电镜 ,流式细胞仪 ,间接免疫荧光等方法检测p5 3对HL - 6 0细胞的促凋亡作用及对p2 1表达的调节作用。结果 :野生型p5 3基因能促进HL - 6 0细胞凋亡及上调p2 1表达。结论 :p2 1可能在p5 3促HL - 6

首次应用反转录病毒仅感染分裂细胞特性构建hTERT驱动野生型p53基因反转录病毒载体质粒

目的:选择只感染分裂细胞的鼠源性反转录病毒载体pLHCX作为载体,构建由hTERT启动子驱动目的基因表达的载体,实现靶向性表达。方法:实验于2005-09/2006-05在江西省分子医学重点实验室完成。①实验材料:含319bp hTERT核心启动子的phTERT-luc质粒由军事科学院郑晓飞博士惠赠,反转录病毒载体质粒pLHCX由浙江大学朱永良教授惠赠,含1.8kb wtp53基因的质粒pCMV-Neo-BamH-wtp53由第二军医大学朱明华教授惠赠,增强型绿色荧光蛋白报告质粒pEGFP-N2和pEGFP-C1由本室保存,对照反转录病毒质粒pLHCX-CMV-EGFP前期构建完成;端粒酶阳性人大肠癌细胞SW620、HT-29,人宫颈癌细胞Hela,人肺癌细胞A549和端粒酶阴性人胚肺成纤维细胞MRC-5由本室保存。②实验方法:利用定向克隆的方法分别构建由hTERT启动子驱动EGFP的质粒pLHCX-hTERT-EGFP和驱动wtp53表达的质粒pLHCX-hTERT-wtp53。以质粒pLHCX-hTERT-EGFP和课题组前期构建的质粒pLHCX-CMV-EGFP转染端粒酶阳性的人大肠癌细胞株SW620和HT-29、人宫颈癌细胞株Hela和人肺癌细胞株A549以及端粒酶阴性的正常人肺胚成纤维细胞MRC-5。③实验评估:通过流式细胞仪测定分析转染效率,证实pLHCX-hTERT-EGFP在不同细胞中的表达特异性。运用RT-PCR和Western Blot分别检测p53mRNA和p53蛋白在p53突变的大肠癌细胞株SW620中表达。利用MTT检测质粒pLHCX-hTERT-wtp53对不同细胞的增殖抑制情况和流式细胞术检测不同细胞的凋亡情况。结果:①通过酶切证实重组质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53构建成功,并通过将pLHCX-hTERT-EGFP转染SW620细胞观察到绿色荧光蛋白的表达,测序证实构建质粒中包含完整的wtp53片段。②流式细胞术检测结果证实质粒pLHCX-hTERT-EGFP处理后端粒酶阳性的SW620、Hela和A549内增强型绿色荧光蛋白表达强度明显强于端粒酶阴性的MRC-5(P<0.05),而pLHCX-CMV-EGFP在端粒阳性和阴性的上述细胞中表达无明显差异(P>0.05)。③RT-PCR和WesternBlot分别证实了p53mRNA和p53蛋白表达。④MTT检测到重组质粒对端粒酶阳性的大肠癌细胞有明显的增殖抑制作用,而对端粒酶阴性的MRC-5细胞生长无明显影响(P<0.05)。⑤流式细胞检测观察到重组质粒引起端粒酶阳性的大肠癌细胞凋亡要明显强于端粒酶阴性的MRC-5细胞(P<0.05)。结论:构建的反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-EGFP在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性表达;重组反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-wtp53转染后对端粒酶阳性的大肠癌细胞有特异性的影响作用。