野生型P53蛋白失活的PC12细胞模型的建立和鉴定

目的建立1种野生型P53蛋白失活的PC12细胞系,为研究PC12细胞生理及病理过程中P53蛋白的功能奠定基础。方法将包含失活突变型p53基因片段P53R175H(其翻译所得P53蛋白的第175位氨基酸Arg被His替换)的缺陷型逆转录病毒质粒包装成具有侵袭能力的逆转录病毒,感染处于对数生长期的PC12细胞,经过嘌呤霉素筛选出稳定转染的PC12细胞,利用Western blotting及细胞生长曲线检测对该细胞进行初步鉴定。结果利用嘌呤霉素成功筛选出转染成功的PC12细胞,并发现该细胞在神经生长因子(NGF)处理后,P21蛋白(P53蛋白直接活化的下游蛋白)未见明显表达,且其增殖能力虽有轻度下降,但仍远高于NGF处理的正常PC12细胞。结论成功建立了野生型P53蛋白失活的PC12细胞系PC12(P53R175H),并鉴定了该细胞在缺失野生型P53蛋白情况下对NGF作用的反应,为探讨P53在PC12细胞中的功能提供了很好的研究工具。

小儿心肌损伤与野生型p53蛋白及NT-proBNP表达的相关性分析

目的探讨小儿心肌损伤与野生型p53蛋白及N-末端脑钠肽前体(NT-proBNP)表达的相关性。方法选取2018年1月~2020年5月于我院接受治疗的心肌损伤患儿40例为观察组,另选取40例同期于本院接受健康体检儿童为对照组,比较两组野生型p53蛋白及NT-proBNP水平,并分析小儿心肌损伤与野生型p53蛋白及NT-proBNP表达的相关性。结果观察组野生型p53蛋白、NT-proBNP水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);经Logistic回归分析结果显示,提示野生型p53蛋白及NT-proBNP水平是导致小儿心肌损伤发生的危险因素(OR>1,P<0.05);绘制ROC曲线,结果显示,野生型p53蛋白及NT-proBNP水平联合预测小儿心肌损伤的AUC为0.960,>0.9,预测价值高。结论野生型p53蛋白、NT-proBNP水平与小儿心肌损伤密切相关,对诊断小儿心肌损伤具有较高的预测价值,可为临床及时实施针对性的治疗方案提供可靠依据。

野生型P53诱导的蛋白磷酸酶1对卵巢癌细胞侵袭的影响

目的:探讨野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)与卵巢癌细胞SKOV3侵袭力的关系,揭示Wip1对SKOV3细胞的侵袭和迁移等恶性生物学行为的影响。方法:采用划痕实验、Transwell小室法测定Wip1沉默后SKOV3细胞体外侵袭能力。实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot方法检测SKOV3细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、组织金属蛋白酶抑制剂1(TIMP-1)、组织金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的表达。结果:细胞迁移距离Wip1-siRNA组(30.33±3.67)短于Control组(59.33±7.69),细胞侵袭到Transwell小室滤膜下细胞数Wip1-siRNA组(17.17±1.84)低于Control组(30.17±3.43),RT-PCR和Western blot检测Wip1-siRNA组MMP-2(0.51±0.01)和MMP-9(0.40±0.03)的表达较Control组(1.00±0.00)降低(均P<0.01);Wip1-siRNA组TIMP-1和TIMP-2的表达与Control组未见差异(P>0.05)。结论:沉默Wip1能够抑制人卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力,可能是通过抑制MMP-2、MMP-9的表达实现的。

野生型p53蛋白及NT-proBNP、CTnI及CK-MB在小儿心肌损伤中的表达

目的探索野生型p53蛋白、NT-proBNP、CTnI及CK-MB在小儿心肌损伤中的表达。方法收集我院确诊为心肌损伤患儿50例作为研究组,同时选取同时期在我院接受健康体检的健康儿童50例作为对照组,分别检测两组血清中野生型p53蛋白、NT-proBNP、CTnI及CK-MB的表达。结果研究组NT-proBNP含量、野生型p53蛋白含量、CTnI含量及CK-MB含量明显高于对照组(P<0.05)。研究组心功能等级越高,其野生型p53蛋白、NT-proBNP、CTnI及CK-MB含量越高(P<0.05)。结论小儿发生心肌损伤时,野生型p53蛋白水平与NT-proBNP水平可作为早期诊断的可靠实验指标,还可指导判断心肌损害的严重程度。

EBV相关性胃癌罕见p53基因突变的可能机制与意义

2014年癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)首次将胃癌从分子水平分为四型,其中EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染型即EBV相关性胃癌(EBV-associated gastric cancer,EBVa GC)患者,可能是免疫治疗的适宜群体。在包括胃癌在内的大部分肿瘤中p53基因突变率最高,但在EBVa GC中p53基因突变率却远低于EBV阴性胃癌(EBV-negative gastric cancer,EBVn GC)。可能机制为:EBV感染是EBVa GC形成的早期事件;野生型p53蛋白与病毒即刻早期蛋白BZLF1(Z)相互作用,维持EBV潜伏感染状态和早期复制;病毒复制后期,野生型p53蛋白可在病毒产物的作用下通过泛素化等途径被降解,以上或可表明p53基因野生型对EBVa GC形成的重要性。而EBV感染诱导炎症反应,肿瘤组织中大量淋巴细胞浸润,基因组高突变率及PD-L1扩增的特征使其可能成为免疫治疗的适宜群体,也说明免疫微环境在肿瘤发生发展中的重要作用。而在EBVn GC中,多种因素导致p53基因突变率较高,使其失去正常的抑癌功能而导致肿瘤发生。本文就EBVa GC中罕见p53基因突变这一现象的可能机制进行综述。

抑制野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1提高肺腺癌细胞对砷剂的敏感性

目的研究抑制野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,WIP1)提高肺腺癌细胞对砷剂的敏感性及其分子机制。方法设计并合成WIP1编码基因的靶向siRNA,以Lipofectimient 2000转染入肺腺癌A549细胞,从而抑制WIP1蛋白的表达。运用Western-blot检测抑制WIP1对三氧化二砷(As_2O_3)诱导的P53磷酸化蛋白及其下游效应因子的影响;采用流式细胞术检测抑制WIP1后细胞凋亡情况;以噻唑蓝(MTT)法检测抑制WIP1后细胞的存活率。结果以siRNA技术成功将A549细胞中WIP1 mRNA和蛋白表达水平均抑制70%左右。相同浓度As_2O_3(5~40μmol/L)处理后,WIP1表达抑制组细胞中P53 ser15表达低于对照组,而P53 ser46表达显著高于对照组。此外,相同浓度As_2O_3(10~40μmol/L)处理后,WIP1表达抑制组中P53 ser15下游效应因子——P53上调凋亡诱导蛋白(P53 up-regulated modulator of apoptosis,PUMA)的表达水平显著低于对照组,而P53ser46下游效应因子——细胞周期调节蛋白P21的表达显著高于对照组。与之对应的是,相同剂量As_2O_3(5~40μmol/L)作用下,WIP1表达抑制组细胞的凋亡率和细胞死亡率均显著高于对照组。结论抑制肺腺癌细胞中WIP1的表达可通过促进P53磷酸化进程提高砷引发肺腺癌细胞凋亡的效率。

热休克蛋白70对X射线照射下wtp53蛋白的影响

目的 探讨反义热休克蛋白 70 (hsc70 )在X射线照射下对野生型p5 3(wtp5 3)的影响。方法 利用脂质体方法将本室构建的反义hsc70真核表达重组质粒pXAhsc70转染wtp5 3的MCF 7乳腺癌细胞 ,PCR证实外源DNA存在。Westernblot检测hsc70蛋白下降程度。X射线照射转染细胞后 ,检测wtp5 3蛋白的表达情况及半衰期变化。结果 转染重组质粒的细胞中hsc70蛋白下降 5 3% ;不同剂量X射线照射下 ,反义hsc70的存在能够提高wtp5 3的表达 ;4Gy相同剂量照射后 ,转染反义hsc70重组质粒的细胞中wtp5 3的半衰期延长。结论 反义hsc70能够上调wtp5 3的表达、稳定X射线照射下的wtp5 3蛋白并延长其半衰期 ;推测hsc70可能参与了wtp5

p53结合蛋白对细胞周期阻滞与细胞凋亡调控的研究进展

p53基因是人体内重要的肿瘤抑制基因，位于人类染色体17p13．1，含有11个外显子，编码的野生型p53蛋白由393个氨基酸残基组成，包含N．末端的转录激活结构域、生长抑制结构域、序列特异的DNA结合结构域（DNAbindingdomain，DBD）、核定位信号（nuclearlocalizationsignal，NLS）、四聚体化结构域和c．末端非专一DNA调节结构域。p53在监视细胞基因组损伤及维持基因组的稳定性中发挥重要作用。当紫外线、电离辐射、氧化应激及癌基因表达等刺激因素引起细胞内DNA损伤时，p53蛋白迅速聚集活化，并作为序列特异性转录因子对一系列靶基因进行调控。

肝内胆管癌中Wip1和MMP-2表达关系及临床意义

目的探讨肝内胆管癌(ICC)中野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达水平及临床意义。方法选取38例ICC患者肝内胆管癌组织标本为研究对象,同期选取36例正常胆管组织标本为对照,采用免疫组织化学(S-P)方法检测组织中Wip1、MMP-2蛋白表达水平,分析二者与ICC临床病理特征之间的关系。结果 ICC组织中Wip1蛋白阳性表达率为78.95%,明显高于正常胆管组织中Wip1蛋白阳性表达率8.33%,差异有统计学意义(P<0.05);ICC组织中MMP-2蛋白阳性表达率为73.68%,明显高于正常胆管组织中MMP-2蛋白阳性表达率5.56%(P<0.05)。Wip1蛋白表达与ICC患者年龄、性别、临床分期、有无肝炎、组织学分级无明显相关性(P>0.05),与患者门静脉浸润、淋巴结转移密切相关(P<0.05);MMP-2蛋白与ICC患者年龄、性别、有无肝炎、组织学分级无明显相关性(P>0.05);与患者临床分期、门静脉浸润、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。Wip1与MMP-2在ICC组织中表达呈较强正相关(γ_s=0.683,P<0.05)。结论 Wip1、MMP-2在ICC中明显高表达,二者参与ICC发生及发展。

Wip1通过P-gp介导人多发性骨髓瘤细胞卡非佐米耐药作用研究

目的 研究野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)在多发性骨髓瘤细胞卡非佐米(CFZ)耐药中的作用及作用机制。方法 以多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226作为研究对象,转染法过表达Wip1设为Wip1组,转染空载体设为NC组,同时以未转染细胞设为Control组;适时以CFZ处理细胞;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白印记实验检测Wip1和P-糖蛋白(P-gp)蛋白表达;免疫荧光实验检测细胞P-gp蛋白表达。结果 与NC组相比,Wip1组Wip1蛋白表达显著上调(P<0.01)。与NC组相比,Wip1组在0.01~100μM CFZ处理后细胞增殖率均显著升高(P<0.01),CFZ对Wip1组细胞IC显著升高(P<0.01)。与NC+CFZ组相比,Wip1+CFZ组细胞凋亡显著降低(P<0.01)。与NC组相比,Wip1组P-gp蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论 Wip1可能通过上调P-gp蛋白表达,诱导人多发性骨髓瘤细胞对卡非佐米耐药。