含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

目的:制备含野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法:设计引物PCR扩增野生型p53cDNA,用T-A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109,提取pGEM-T/p53重组体,双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选pL(p53cDNA)SN重组体,脂质体法转染包装细胞AM12,G-418(geneticin)筛选,收集病毒液。结果:通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆,收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论:含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。

人野生型p53 cDNA的克隆、表达和意义

目的：为探讨肿瘤细胞ｗｔｐ５３蛋白功能失活机制的研究，检测肿瘤患者血清抗ｐ５３抗体辅助临床诊断提供人ｗｔｐ５３蛋白。方法：将人ｗｔｐ５３基因ｃＤＮＡ片段插入到大肠杆菌表达载体ｐＱＥ－３０中，得到重组表达质粒ｐＱＥ３０－ｐ５３；用ｐＱＥ３０－ｐ５３重组质粒转化大肠杆菌Ｍ１５细胞，转化菌落经ＰＣＲ扩增和ＢａｍＨⅠ、ＸｂａⅠ酶切证实ｐ５３基因插入。ＩＰＴＧ诱导大肠杆菌表达ｗｔｐ５３蛋白，通过Ｎｉ－ＮＴＡ亲和层析柱纯化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离。结果：ＩＰＴＧ诱导后的大肠杆菌出现明显的５３ｋＤ蛋白带，免疫印迹进一步证实：大肠杆菌可表达高水平的人ｗｔｐ５３蛋白。结论：这种原核细胞表达的人ｗｔｐ５３蛋白具有天然的ｐ５３蛋白的抗原性，可用于ｐ５３蛋白的体外分析。

野生型p53基因与双脱水二乙酰卫矛醇联合诱导肝癌HLE细胞凋亡的研究

背景和目的:p53基因是抑癌基因,研究发现在人类肿瘤中p53基因常发生突变。实验证明野生型p53基因不但抑制肿瘤细胞增殖,而且诱导肿瘤细胞凋亡。但是,单独应用野生型p53基因诱导肿瘤细胞凋亡的作用不很明显。因此,野生型p53基因与药物的联合作用来提高肿瘤细胞凋亡率是目前对肿瘤研究的一新领域。本实验通过转染野生型p53基因联合双脱水二乙酰卫矛醇(1,2:5,6-dianhydro-3,4-diacetylgalactitol,DADAG)作用于肝癌细胞株HLE,研究联合诱导肿瘤细胞的凋亡作用。方法:野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞株HLE,同时加入DADAG。96h后,用流式细胞仪、DNA电泳方法进行细胞凋亡分析。结果:流式细胞仪分析细胞凋亡结果:阴性对照组为1.4%、转染pUHD10-3组为3.5%、DADAG处理组为32.6%、转染pUHD10-3-p53组为43.4%、转染p53基因及DADAG处理组为74.6%。DNA电泳发现,转染p53基因及DADAG处理组有到DNA梯形条带。结论:野生型p53基因与DADAG均可诱导人肝癌细胞HLE发生凋亡,转染野生型p53基因与DADAG联合作用,有促进肝癌细胞凋亡的作用。

野生型P53、P16基因协同对肺腺癌细胞系生长抑制作用的研究

为了探讨野生型P5 3基因及P16基因在恶性肿瘤基因治疗中的作用 ,用腺病毒为载体将野生型P5 3基因转入高、低转移的肺腺癌细胞系Anip973、AGZY83 -a和经野生型P16基因质粒转染的高、低转移肺腺癌细胞系Anip973(Anip973P16 )、AGZY83-a(AGZY83-aP16 )。对各组转染细胞进行生长曲线、MTT生长抑制率、原位末端标记、Western -blotting等技术检测分析。结果发现 (1)野生型P5 3蛋白的过表达对上述肺腺癌细胞系均呈现出较强的生长抑制作用。 (2 )野生型P5 3蛋白的过表达对高转移肺癌细胞系Anip973的抑制作用明显高于低转移细胞系AGZY83 -a。 (3)野生型p5 3蛋白的过表达对经野生型P16基因转染的高、低转移的肺癌细胞Anip973、AGZY83-a抑制作用明显高于未经P16基因转染的细胞。野生型P5 3基因可以作为肺腺癌基因治疗的候选基因。肿瘤抑制基因P5 3、P16的联合转染可能是对肺腺癌进行基因治疗的有效手段。

宫颈鳞癌组织中HPVE6与野生型p53和PinX1表达的关系及其临床意义

目的探讨宫颈鳞癌、宫颈鳞癌癌旁及正常宫颈组织中HPV E6、野生型p53及Pin X1表达及其关系。方法收集第三军医大学大坪医院野战外科研究所妇产科2013年3月至2014年2月17例宫颈鳞癌患者宫颈鳞癌、宫颈鳞癌癌旁组织,选取10例正常宫颈组织作为对照。采用Real-Time PCR、Western blot、免疫组织化学方法检测3组组织中HPV E6、野生型p53和Pin X1的mRNA、蛋白的表达及分布。结果宫颈鳞癌组织中mRNA及蛋白水平结果均显示HPV E6的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01),而野生型p53和Pin X1的表达水平明显低于癌旁及正常组织(P<0.05)。相关性分析提示:宫颈鳞癌组织中野生型p53(R=-0.605,P<0.01)和Pin X1(R=-0.496,P<0.05)表达水平的下降与HPV E6的表达水平升高存在负相关,野生型p53与Pin X1的表达呈正相关(R=0.824,P<0.01)。结论宫颈鳞癌组织中HPV E6表达上调与野生型p53、Pin X1的表达负相关,Pin X1的表达与野生型p53密切相关,HPV E6可能通过抑制野生型p53、Pin X1导致宫颈鳞癌的发生、发展。

野生型P53及其调控基因与子宫颈癌发病机制

P53基因是迄今发现与人类肿瘤的发生相关性最高的抑癌基因,在人类癌症中发生突变的频率高达50%。在子宫颈癌组织中表达则降低,且以野生型(wt)为主。wtP53第4外显子72密码的基因多态性与子宫颈癌发病机制密切相关。wtP53蛋白在子宫颈癌细胞中半衰期短,功能易失活,具有调节细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长的功能。其功能失活与多种基因,如E6,E7,MDM2和STAT3等基因的降解作用有关。

野生型p53基因在人肝癌细胞的表达及诱导其凋亡

目的:探讨外源性野生型p53基因(wt-p53)对人源性肝癌细胞系生物学的影响。方法:用脂质体转染法将真核表达质粒p53-pcDNA3转染人源性肝癌细胞系HepG2中,用G418筛选细胞;用生物素标记p53的cDNA探针,通过RNA原位杂交方法,检测p53-pcDNA3在细胞中的表达;用流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡指数。结果:G418筛选出了阳性转染细胞;RNA原位杂交显示HepG2的胞质成棕黄色,证明了p53的表达;FCM检测表明,转染p53-pcDNA3的HepG2细胞,其增殖能力下降,细胞凋亡指数由转染前的10.03%上升为54.17%。结论:外源性wt-p53可通过脂质体转染法在HepG2细胞中成功表达,并诱导其发生凋亡,有较好的临床应用前景。

转染野生型p53对乳腺癌细胞所致细胞凋亡的研究

目的 为研究 p5 3对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响 ,用重组人野生型 p5 3全长 c DNA的逆转录病毒载体转染Bcap37细胞 ,观察其增殖的凋亡变化。方法 应用 Northernblotting和 Western blotting检测 Bcap37细胞 p5 3表达变化 ,流式细胞仪计数检测细胞增殖及周期变化 ,MTT及苔盼兰计数观察紫外线刺激后细胞存活率差异 ,DNA末端原位标记技术检测细胞凋亡变化。结果 外源野生型 p5 3在Bcap37细胞表达后 ,使细胞生长速度变慢 ,克隆形成所需时间增加 ,并使细胞周期发生变化 ,主要表现在 G1 期生长抑制 ,即细胞停滞于 G1 期 ,紫外线刺激后 ,细胞存活率比对照细胞下降 2 0 %～ 40 % ;细胞凋亡明显增加 (所有数据均 P<0 .0 1)。结论 转染野生型 p5 3的 Bcap37细胞出现生长抑制 ,并加速 U

野生型p53基因重组质粒的构建及其对人肠癌细胞的抑瘤效应

人p53基因是一种抑癌基因,p53蛋白作为一种细胞增殖的负调节因子,调控细胞的生长和分化,维持基因组DNA的稳定,其突变、缺失或与细胞、病毒、肿瘤蛋白结合所致的p53失功能,在恶性肿瘤发生发展中起着非常重要的作用.为了进一步探讨野生型p53基因的抗肿瘤特性,我们采用分子克隆方法将人野生型p53基因(WT-p53)cDNA全长正向插入到哺乳动物表达载体(pREP9)的BamHl位点,构建了pREP9-p53重组体,用电穿孔方法将其导入有p53基因突变的人肠癌SW1116细胞,通过标记基因Neo^R筛选带外源p53基因的G418抗药性克隆,以观察抗药性克隆数量,同时对G418抗药性细胞的生长速度及细胞增殖周期进行观察.结果表明,导入WT-p53基因能使肠癌SW1116细胞的G418抗药性克隆形成减少,细胞生长速度较对照细胞明显减慢,细胞增殖周期GI期增加、S期下降.这些结果证明人野生型p53基因能抑制肠癌细胞的生长.本研究为大肠癌WT-p53实验性基因治疗提供了理论依据,说明基于恢复P53肿瘤抑制基因功能的基因治疗在治疗结、直肠癌方面有着广阔的应用前景.

野生型P53基因对肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响

目的:观察野生型p53基因对昆明鼠肝癌组织端粒酶活性及bcl-2表达的影响,探讨p53基因的抑瘤机制.方法:♂5周龄昆明鼠30只,随机分类肝癌组(Ⅰ)和p53基因治疗组(Ⅱ).每只鼠于后肢股部皮下接种Hep-A-22肝癌细胞悬液0.2mL,建立动物模型.接种后24h,Ⅱ组实验动物于荷瘤局部皮下注射介导野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒液0.2mL,14d后处死实验动物.PCR-ELISA定量检测肝癌组织端粒酶活性,免疫组化观察肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达情况.结果:腺病毒介导的野生型p53基因能够显著抱制肝癌的生长(肿瘤直径23.32±1.45cmvs5.13±0.37cm,P<0.001),明显降低端粒酶的活性表达(A值2.46±0.35vs0.78±0.06,P<0.01),下调Bcl-2基因蛋白的生成(表达阳性率67.8%vs25.9%,P<0.05).结论:野生型p53基因从抑制肝瘤细胞增生,促进肿瘤细胞凋亡两个方面发挥抑癌功能.

野生型p53基因转移对血管内膜损伤后再狭窄的防治作用

为防止血管成形术后管腔再狭窄，我们构建了介导野生型ｐ５３基因转移的复制缺陷型重组腺病毒（Ａｄ－ｐ５３），将Ａｄ－ｐ５３感染日本大耳兔球囊损伤后的髂动脉，并通过携带ＬａｃＺ基因重组腺病毒感染观察基因转染效率。结果可见Ａｄ－ｌａｃＺ感染损伤后的动脉３天后血管内膜、中膜、外膜均有ＬａｃＺ基因的阳性表达；Ａｄ－ｐ５３感染损伤后的髂动脉２周后可见血管内膜增厚程度、内膜与中膜的比例明显减小，管腔狭窄程度明显减轻，ｐ５３蛋白大量表达，与对照组相比具有显著差异。证明野生型ｐ５３基因转移能明显抑制血管损伤后的内膜增殖，为野生型ｐ５３基因转移防治血管内膜损伤后再狭窄奠定了实验基础。

外源野生型p53基因表达对人肺癌细胞药物敏感性影响

目的 了解外源野生型p5 3(wild typep5 3 ,wtp5 3)基因表达对人大细胞肺癌 80 1 D细胞对化疗药物敏感性的影响。方法 选用p5 3基因突变的人大细胞肺癌 80 1 D系。用脂质体介导构建的含wtp5 3基因载体转染 80 1 D细胞 ,PCR检测外源wtp5 3在宿主细胞存在情况 ,3H TdR掺入法测定 80 1 D细胞转染wtp5 3后药物敏感性变化 ,流式细胞仪 (FACS)分析细胞死亡情况。结果 转染wtp5 3在 80 1 D细胞有效表达 ,FACS分析转染细胞死亡率为 2 0 .1%。对多种抗癌药物筛选 ,转染wtp5 3细胞对顺铂和5 氟脲嘧啶敏感性分别提高 9.7和 11.4倍 ,对非DNA损伤制剂和其它DNA损伤制剂的敏感性无变化 ;DNA断裂电泳分析和形态学观察显示细胞呈坏死特征。结论 wtp5 3可选择性增加 80 1 D细胞对某些DNA损伤制剂的敏感性 ,其调节机制可能以非凋亡途径为主 。

野生型p53基因对胰腺癌细胞的抑制作用

目的 观察人类野生型p5 3 (wtp5 3 )基因对人胰腺癌细胞系的抑制作用。方法 用逆转录病毒为载体将外源性wtp5 3基因导入人胰腺癌细胞系PC -2 ,通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用。结果 p5 3在转染细胞PC -2 /p5 3中表达水平提高。外源性wtp5 3基因的导入和表达能使PC -2细胞的生长速率减低 ,软琼脂集落形成能力下降 ,G0 +G1期细胞比例增加 ,凋亡指数升高 ,裸鼠体内成瘤能力明显下降。结论 逆转录病毒载体介导的外源性野生型p5

野生型P53蛋白失活的PC12细胞模型的建立和鉴定

目的建立1种野生型P53蛋白失活的PC12细胞系,为研究PC12细胞生理及病理过程中P53蛋白的功能奠定基础。方法将包含失活突变型p53基因片段P53R175H(其翻译所得P53蛋白的第175位氨基酸Arg被His替换)的缺陷型逆转录病毒质粒包装成具有侵袭能力的逆转录病毒,感染处于对数生长期的PC12细胞,经过嘌呤霉素筛选出稳定转染的PC12细胞,利用Western blotting及细胞生长曲线检测对该细胞进行初步鉴定。结果利用嘌呤霉素成功筛选出转染成功的PC12细胞,并发现该细胞在神经生长因子(NGF)处理后,P21蛋白(P53蛋白直接活化的下游蛋白)未见明显表达,且其增殖能力虽有轻度下降,但仍远高于NGF处理的正常PC12细胞。结论成功建立了野生型P53蛋白失活的PC12细胞系PC12(P53R175H),并鉴定了该细胞在缺失野生型P53蛋白情况下对NGF作用的反应,为探讨P53在PC12细胞中的功能提供了很好的研究工具。

肺腺癌高、低转移细胞系Anip973、AGZY83-a中野生型p53基因过表达研究

目的探讨野生型ｐ５３基因及其表达产物ｐ５３蛋白在恶性肿瘤基因治疗中的作用。方法应用腺病毒为载体将野生型ｐ５３基因转入高、低转移的肺癌细胞系Ａｎｉｐ９７３、ＡＧＺＹ８３－ａ，并且对各组转染细胞进行生长曲线、原位末端标记、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ等技术检测分析。结果野生型ｐ５３蛋白的过表达对上述肺腺癌细胞系均呈现出较强的生长抑制作用，野生型ｐ５３蛋白的过表达对高转移肺癌细胞系Ａｎｉｐ９７３的抑制作用明显高于低转移细胞系ＡＧＺＹ８３－ａ。结论外源性野生型ｐ５３基因的过表达，可以有效抑制上述肿瘤细胞的增殖，同时对高转移肺腺癌细胞系的抑制作用更加显著。

尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响

目的:研究尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因转染对人肺腺癌细胞系H1299(p53基因缺失)的增殖抑制和凋亡诱导作用。方法:UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,采用荧光显微术、RT-PCR法和West-ernblot法分别检测细胞内绿色荧光蛋白(GFP)、wt-p53mRNA和蛋白的表达,并通过MTT法分析基因转染对细胞的生长抑制作用,DAPI染色法和琼脂糖凝胶电泳法评价其对细胞的诱导凋亡作用。结果:UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,大量细胞表达GFP,细胞内wt-p53mRNA和蛋白表达水平明显上调,细胞生长受到显著地抑制,凋亡细胞数量明显增加,并有清晰的DNA梯状条带出现。结论:UAC介导wt-p53基因转染能够显著地抑制人肺腺癌细胞系H1299的增殖,并诱导其凋亡。

野生型p53基因转移抑制兔心肌细胞生长的实验研究

目的 探讨野生型 p5 3基因转移对兔心肌细胞生长的抑制作用及 p5 3基因用于心肌肥厚基因治疗的可能性。方法 将腺病毒介导的野生型 p5 3基因转入体外培养的乳兔心肌细胞 ,应用生化染色方法、Westernblot杂交检测野生型 p5 3基因的转染效率及表达结果 ,采用透射电镜、MTT增殖抑制实验 (MTT)及流式细胞仪细胞周期分析方法研究野生型 p5 3基因对细胞生长的抑制作用。结果 重组腺病毒能有效地将野生型 p5 3基因转入心肌细胞中 ,并且检测到 p5 3基因表达 ;转入的 p5 3基因导致心肌细胞收缩、体积变小 ;MTT结果显示 ,野生型 p5 3基因能够抑制心肌细胞生长 ,且生长抑制率呈现时间和剂量依赖性 ;心肌细胞增殖周期结果显示 ,细胞G0 - G1 期 DNA百分含量明显高于对照组 ,提示发生 G1 期阻滞。结论 野生型 p5 3基因能高效转染体外培养的心肌细胞 ,对心肌细胞生长有明显的抑制作用 ,其抑制作用的机理是由于野生型 p5 3基因影响心肌细胞的增殖周期 ,以上结果为心肌肥厚的基因治疗提供了重要的实验依据。

HCMV的IE2介导野生型p53基因促凋亡作用的研究

选择野生型P5 3缺失型的Jurkat细胞系 ,首先将wt p5 3 pLXSN稳定转染入Jurkat细胞 (Jurkat wt p5 3) ,再分别或联合转染IE1、IE2基因 ,并利用流式细胞仪分析。结果显示 ,转染了IE2基因的Jurkat wt p5 3细胞在瞬时转染 2 4h后出现光镜下可见的细胞凋亡改变 ,此时取样进行流式细胞仪测定细胞周期分布状况 ,可见转染了IE2基因的Jurkat wt p5 3细胞周期分布较其他各组发生了明显的变化 ,G1期和S期细胞分布减少 ,而G2 期细胞增多 ,细胞阻滞于G2 /M期 ,并且出现了细胞凋亡亚二倍体峰 ,引起细胞凋亡。研究表明 ,在Jurkat细胞中HCMV的IE2基因可介导野生型p5 3基因的促凋亡作用。