酶法制备野黄芩素的工艺研究

目的应用黄芩茎叶葡萄糖醛酸水解酶(Scutellaria baicalensis stems and leaves glucuronic hydrolase,sbsl GUS)酶解灯盏花中野黄芩苷制备野黄芩素,经分离纯化获得高纯度的野黄芩素提取物。方法采用正交试验优选灯盏花提取工艺参数;以野黄芩苷酶解转化率为指标,对酶用量、酶解pH值、温度、时间、抗氧化剂等进行考察,优选野黄芩素制备工艺参数;采用乙醇提取、活性炭脱色和分步结晶精制纯化粗提物。结果灯盏花提取工艺为灯盏花切段,加10倍水煎煮提取2次,每次1 h。野黄芩素制备工艺为sbsl GUS提取液和灯盏花水煎液加入量(以生药计)比为1∶10,加0.5%偏重亚硫酸钠,酶解pH值约6.0,温度约45℃,时间20 h,得到含量大于60%的野黄芩素粗提物。经分步结晶对粗提物进行纯化,用80%乙醇回流提取,活性炭脱色,浓缩、析晶,得到含量大于85%的野黄芩素提取物。结论该工艺应用sbsl GUS酶解技术制备野黄芩素,生产简便可行,为野黄芩素的生产制备提供了新的途径。

野黄芩素通过促进胆固醇外流途径抑制巨噬细胞泡沫化的作用机制

目的探究野黄芩素对巨噬细胞泡沫化及胆固醇外流作用的影响及潜在机制。方法使用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)诱导THP-1细胞巨噬化,并通过MTT法检测不同浓度野黄芩素对巨噬细胞活力的影响;利用胆固醇含量检测试剂盒及NBD荧光标记胆固醇测定不同浓度野黄芩素对巨噬细胞胆固醇蓄积和外流作用的干预效果;采用分子对接、ELISA、双荧光素酶报告基因和Western blot法确定野黄芩素对PPARγ-LXRα-ABCA1信号通路的激活情况;利用siRNA干扰技术分析PPARγ基因沉默对野黄芩素增强胆固醇外流途径和抑制巨噬细胞泡沫化的影响。结果野黄芩素可剂量依赖性地抑制oxLDL诱导的胆固醇蓄积,加速胆固醇外流途径并明显提高LXRα和ABCA1蛋白表达;同时,野黄芩素可结合PPARγ,并启动其下游LXRα-ABCA1信号通路。此外,PPARγ的基因沉默不仅明显抑制了野黄芩素诱导的LXRα-ABCA1信号通路和胆固醇外流途径,还可逆转野黄芩素对巨噬细胞泡沫化的抑制作用。结论野黄芩素可激活PPARγ并通过启动下游LXR-ABCA1信号通路,促进胆固醇外流途径,进而抑制巨噬细胞泡沫化。

野黄芩素及其葡萄糖醛酸结合物在大鼠体内的药动学研究

目的建立测定大鼠血浆中野黄芩素及其代谢产物葡萄糖醛酸结合物浓度的UPLC-MS／MS法，并讨论两者在大鼠体内的药代动力学过程。方法色谱采用Waters BEH C18色谱柱，流动相为0．1％甲酸乙腈-0．1％甲酸水溶液，梯度洗脱，质谱采用多反应监测（MRM）进行正离子检测野黄芩素。大鼠静脉给予野黄芩素，测定给药后不同时间的野黄芩素的血药浓度；采用酶解方式间接测定野黄芩素葡萄糖醛酸结合物的血药浓度，以DAS2．0软件获得药动学参数。结果野黄芩素在0．116—28．2mg·L-1呈良好线性相关，提取回收率为80．5％～90．0％，精密度、准确度、稳定性良好。药代动力学研究结果表明静脉给予野黄芩素后其原型及其葡萄糖醛酸结合物药代动力学过程均符合二室模型。结论本研究所建立的方法具有灵敏度高，重现性好，操作简便等特点，可用于同时测定野黄芩素及其葡萄糖醛酸结合物在体内的浓度，便于原型药物及其代谢物产物的药动学研究。

野黄芩苷和野黄芩素制备研究进展

野黄芩苷是灯盏细辛中主要生物活性的黄酮类成分,具有扩张脑血管、降低脑血管阻力、增加脑血流量、改善微循环、抗血小板聚集等多种药理作用,目前已广泛用于临床治疗各种心、脑血管疾病。野黄芩素是其苷元及活性代谢物,相比野黄芩苷具有更好的活性。野黄芩苷和野黄芩素也就成为治疗心脑血管疾病等问题研究的热点。本文对野黄芩苷和野黄芩素的制备方法进行了综述,为它们进一步开发利用提供依据。

野黄芩素对大鼠急性咽炎的治疗作用

为了探究野黄芩素对急性咽炎的治疗作用,本研究将60只大鼠分为5组:空白组、急性咽炎模型组、野黄芩素低剂量组、野黄芩高剂量组和阳性药对照组,采用HE染色,血液细胞分析仪,IL-6、IL-1β、TNF-αELISA试剂盒考察野黄芩素对急性咽炎大鼠体征状态,咽部组织形态,白细胞、中性粒细胞数目,血清IL-6、IL-1β、TNF-α浓度的影响。将40只小鼠分为4组:空白组、野黄芩低剂量组、野黄芩素高剂量组和阳性药对照组,采用小鼠热板实验和扭体实验考察野黄芩素的镇痛作用。实验结果发现:与模型组相比,2.5、10 mg/kg野黄芩素均可改善急性咽炎大鼠的体征状态和咽部组织形态,显著减少白细胞和中性粒细胞数目(P<0.05,P<0.01),显著降低大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.01);同时,10 mg/kg野黄芩素可以极显著提高热板实验中小鼠的痛阈值,并减少醋酸所致的扭体次数(P<0.01)。实验结果表明,野黄芩素对大鼠急性咽炎具有潜在治疗作用,具有良好的治疗前景。

野黄芩苷和野黄芩素在Caco-2细胞模型中的吸收转运特性

目的:研究黄酮类化合物野黄芩苷(scutellarin)和野黄芩素(scutellarein)在Caco-2单层细胞模型中的吸收和转运特性。考察缓冲液、作用时间、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)抑制剂、多药耐药蛋白2(multidrug resistance protein 2,MRP2)抑制剂、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer drug resistance protein,BCRP)抑制剂对野黄芩苷和野黄芩素吸收转运的影响。方法:利用Caco-2单层模型研究从绒毛面(apical,AP)侧到基底面(basolateral,BL)侧以及从BL侧到AP侧两个方向的转运过程。应用高效液相色谱法定量分析,计算转运参数和表观渗透系数(apparent permeability coefficient,Papp)。结果:两化合物在磷酸盐缓冲液和Hanks缓冲液中的Papp有差异。在磷酸盐缓冲液中野黄芩苷AP→BL侧无转运,BL→AP侧的Papp为(0.74～1.58)×10-6cm/s;野黄芩素在AP→BL侧与BL→AP侧的Papp分别为(4.33～6.79)×10-6cm/s和(1.32～2.56)×10-6cm/s。随着时间延长,Papp逐渐下降,野黄芩素的吸收转运优于野黄芩苷。P-gp抑制剂维拉帕米、MRP2抑制剂MK-571钠盐及BCRP抑制剂利血平能够促进野黄芩苷的吸收转运,维拉帕米能促进野黄芩素的吸收转运,MK-571钠盐促进野黄芩素外排。结论:野黄芩苷属于难吸收的化合物,野黄芩素吸收优于野黄芩苷,野黄芩素可通过小肠上皮被动吸收进入体内。P-gp抑制剂能够促进野黄芩苷和野黄芩素的转运,MRP2抑制剂和BCRP抑制剂能够促进野黄芩苷的转运,MRP2抑制剂促进野黄芩素外排。野黄芩苷吸收不良和外排蛋白的作用是造成其生物利用度较低的原因。

灯盏花乙素水解制备野黄芩素

在乙醇-水溶液中对灯盏花乙素进行酸水解制备野黄芩素,用正交试验对水解工艺进行优化.得到最佳水解条件:温度80℃,硫酸浓度20%(质量分数),乙醇浓度80%(体积分数),固液比1∶2(质量-体积比,mg/mL),反应时间3.5 h,该条件下的平均收率为90.7%.利用紫外光谱和核磁共振氢谱对其结构进行了表征.

野黄芩素通过PI3K/Nrf2/HO-1途径减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤

目的探讨野黄芩素(SCT)对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠表达血红素氧合酶-1(HO-1)的机制。方法大鼠静脉内注射LPS(30 mg/kg)以诱导ALI。1h后分别给予不同浓度的SCT(0.1,0.5和1.0 mmol/kg)静脉注射。获肺组织标本,实时定量PCR和Western blot分别检测血红素氧合酶-1(HO-1)mRNA及蛋白的表达;比色法检测HO-1酶活性;HE染色观察病理学改变情况。提取组织总蛋白和核蛋白,Western blot检测PI3K磷酸化以及Nrf2核转位情况,同时观察SCT处理前后对大鼠血浆中TNF-α,IL-6和IL-10水平的影响。结果 LPS注射后肺组织中HO-1 mRNA和蛋白表达水平有所增加,而SCT处理后能进一步上调HO-1表达水平,并能增强其酶活性。同时,SCT也可促进PI3K磷酸化,并能诱导转录因子Nrf2核转位。此外,0.5和1.0 mmol/kg的SCT能减少大鼠血浆中TNF-α和IL-6含量,并能进一步增加IL-10水平。HO-1抑制剂Sn PP处理后可消除SCT对细胞因子的影响。结论 SCT可能通过激活PI3K/Nrf2诱导HO-1表达来减轻LPS所致炎症反应。

四乙酰野黄芩素的合成

以灯盏花素为原料,在乙二醇-水-盐酸体系中,将原料中的灯盏花乙素水解转化为野黄芩素;中间体野黄芩素在醋酸钾与吡啶的共同催化作用下,经醋酐酰化制得最终产物四乙酰野黄芩素。第一步反应产率为81.3%,所得产物野黄芩素纯度达99.8%;第二步反应产率86.1%,所得产物四乙酰野黄芩素纯度达98.4%。所得产物结构经UV,IR,MS,13CNMR,1HNMR所证实。

野黄芩素对内毒素血症大鼠急性肺损伤的保护作用

目的观察野黄芩素对脂多糖诱导的急性肺损伤的保护作用。方法将大鼠静脉内注射脂多糖(30mg/kg)以诱导急性肺损伤。1 h后分别静脉注射不同浓度的黄芩素(0.1、0.5和1.0 mmol/kg),酶联免疫吸附试验法检测血浆中肿瘤坏死因子α,白细胞介素6和白细胞介素10的浓度;还原法检测肺组织中亚硝酸盐/硝酸盐的含量;实时定量聚合酶链式反应和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测一氧化氮合成酶和血红素氧合酶-1m RNA及蛋白的表达;HE染色观察病理学改变情况。结果 0.5和1.0 mmol/kg的黄芩素能减少大鼠血浆中肿瘤坏死因子α和白细胞介素6含量,并能进一步增加白细胞介素10水平。脂多糖注射后肺组织中一氧化氮合成酶蛋白表达和血浆中一氧化氮含量显著增加,而黄芩素处理后一氧化氮合成酶和一氧化氮水平明显减少。脂多糖能诱导血红素氧合酶-1表达,但黄芩素处理后能进一步上调血红素氧合酶-1表达水平。血红素氧合酶-1抑制剂锡原卟啉处理后可消除黄芩素对细胞因子及一氧化氮合成酶表达的影响。此外,黄芩素还能减少肺组织水肿及中性粒细胞渗出。结论黄芩素可能通过诱导血红素氧合酶-1表达来减轻脂多糖诱导的急性肺损伤。

野黄芩素和白杨素的溶解度与稳定性研究

目的:观察野黄芩素和白杨素在纯水溶液中的溶解度以及在HBSS溶液中的稳定性,为药物的代谢研究和样品制备提供依据。方法:以药物在50%甲醇中的溶解度为标准,建立药物在纯水中的溶解度曲线,并观察药物在HBSS溶液中含量随时间变化的曲线,作为判断药物稳定性的依据。野黄芩素和白杨素的含量采用高效液相色谱法进行测定。结果:野黄芩素在0-102.4μM范围内可完全溶解,7天内在0～25μM范围性质稳定。白杨素在0～25.6μM范围内可完全溶解,2天内在0～25μM范围性质稳定,7天内在0～12.5μM性质稳定。结论:野黄芩素和白杨素均在20μM的HBSS溶液溶解性和稳定性最好。

野黄芩素协同ABT-737抗头颈鳞癌作用的研究

目的:研究野黄芩素协同ABT-737在体外对人头颈鳞癌HN30细胞的凋亡诱导作用,探讨其可能的作用机制。方法:MTT法检测野黄芩素协同ABT-737抑制细胞增殖作用;流式细胞术检测细胞凋亡;JC-1染色法检测线粒体膜电位变化;western blotting检测细胞凋亡蛋白的表达;利用SiRNA技术沉默基因表达。结果:野黄芩素协同ABT-737在体外对人头颈鳞癌HN30细胞增殖有抑制作用,且呈量效关系;两者可协同诱导HN30细胞凋亡;使线粒体膜电位去极化;下调抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL表达,上调Bax表达;SiRNA抑制Mcl-1表达可以显著增强野黄芩素和ABT-737协同诱导HN30细胞凋亡的作用。结论:野黄芩素在体外可以协同ABT-737诱导人头颈鳞癌HN30细胞凋亡,野黄芩素下调Mcl-1蛋白的表达,抑制Mcl-1对ABT-737抗肿瘤作用的影响,是两者协同作用的机制。

星点设计优化野黄芩素制备工艺

采用星点设计法(Central composite design,CCD)优化灯盏乙素水解制备野黄芩素的反应条件。选取反应温度及介质固液比为主要考察因素,归一化法合并产品收率及反应时间为评价指标,采用Statistica 6.0及SAS软件进行试验设计并分析试验结果。反应温度及介质固液比对试验结果影响显著,并确定酸水解法制备野黄芩素的最优反应条件为固液比(g/L)15(0.15g灯盏乙素加入10m L95%乙醇)、反应温度80℃,在此条件下可通过较短时间得到较为理想的产物收率。CCD优化野黄芩素制备工艺直观、高效,值得推广应用。

野黄芩素药物代谢动力学及药物剂型研究进展

通过查阅近年来国内、外相关文献,对野黄芩素的药物代谢动力学性质、药物剂型的研究情况进行综述。

考察野黄芩素和白杨素的溶解度和稳定性

目的:考察野黄芩素和白杨素在纯水溶液中的溶解度以及在HBSS溶液中的稳定性,为药物的代谢研究和样品制备提供依据。方法:以药物在50%甲醇中的溶解度为标准,建立药物在纯水中的溶解度曲线,并考察药物在HBSS溶液中含量随时间变化的曲线,作为判断药物稳定性的依据。野黄芩素和白杨素的含量采用高效液相色谱法进行测定。结果:野黄芩素在0μM～102.4μM范围内可完全溶解,在7 d内0μM～25μM范围性质稳定。白杨素在0～25.6μm范围内可完全溶解,在2 d内0μM～25μM范围性质稳定,在7 d内0μM～12.5μM性质稳定。结论:野黄芩素和白杨素均在20μM的HBSS溶液溶解性和稳定性最好。

微生物转化灯盏乙素制备野黄芩素的研究

目的野黄芩素较其糖苷——灯盏乙素具有更好的生理活性,开发将灯盏乙素转化为野黄芩素的生物转化工艺具有潜在的应用价值。方法筛选专一性高的微生物菌株,利用其发酵清液作为粗酶液转化灯盏乙素为野黄芩素,优化产酶发酵培养基和转化条件,提高野黄芩素转化得率和产率。结果筛选到一株黑曲霉JH-2菌株,该菌株产酶转化灯盏乙素为野黄芩素的专一性较高,产物降解性弱;优化后的较佳培养基组成为:蔗糖20 g/L,(NH_4)_2SO_4 5 g/L,酵母浸出粉3 g/L,KH_2PO_4 1 g/L,MgS O4 0.5 g/L,FeSO_4 0.01 g/L,pH 6.0;经转化条件优化后,提高了底物浓度和产物得率,在底物浓度为3 g/L,35℃下转化12 h,野黄芩素的得率可达93.7%。结论成功开发了一种简便高效的野黄芩素制备方法,具有一定的应用价值。

野黄芩素经Akt/FoxO1信号通路抑制视网膜神经节细胞凋亡

目的探讨野黄芩素经Akt/叉头状转录因子O1(FoxO1)信号通路抑制视网膜神经节细胞(RGC)凋亡的机制。方法构建视网膜神经RGC-5细胞氧化应激损伤模型,野黄芩素组分别给与25和100μmol/L野黄芩素,阳性对照组给予25μmol/L拉坦前列素,设模型组和阴性对照组。检测各组细胞增殖和凋亡情况,以及RGC-5细胞活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)及凋亡相关蛋白的水平。结果与阴性对照组比较,其他组细胞增殖率、SOD、p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)水平降低,细胞凋亡率、ROS、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和Caspase-3水平增加(P<0.05)。与模型组比较,野黄芩素组和阳性对照组细胞增殖率、SOD、p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1和Bcl-2水平增加,细胞凋亡率、ROS、Bax和Caspase-3水平降低;且随野黄芩素剂量增加差异更为显著,但阳性对照组作用最明显(P<0.05)。结论野黄芩素可以抑制RGC-5细胞凋亡,其机制可能与激活Akt/FoxO1信号通路有关。

野黄芩素在结肠癌发生发展中的作用机制研究

目的探究野黄芩素在结肠癌发生发展中的作用机制。方法分别应用MTT、流式细胞术、划痕、Transwell小室及小鼠荷瘤实验等方法,检测野黄芩素对结肠癌T84细胞增殖、凋亡、转移、侵袭及成瘤能力的影响;应用Western Blot技术检测野黄芩素对Bcl-2/Bax、caspase3/9、ERK1/2、p-ERK1/2、表皮生长因子受体(EGFR)、c-myc、c-fos蛋白表达的影响;应用免疫共聚焦技术检测野黄芩素处理后ERK1/2蛋白的亚细胞定位。结果野黄芩素处理可降低T84细胞的增殖活性、转移、侵袭及成瘤能力,促进细胞凋亡;降低EGFR、p-ERK1/2、c-myc及c-fos的表达,促进ERK1/2蛋白出核;过表达EGFR后,野黄芩素对T84细胞的增殖、成瘤的抑制作用及促进细胞凋亡作用明显降低(P<0.05)。结论野黄芩素可通过抑制EGFR/ERK1/2通路的激活抑制结肠癌的发生发展。

野黄芩素改善高糖诱导小胶质细胞活化引起的血脑屏障功能障碍

目的研究野黄芩素(scutellarein)对高糖诱导的小胶质细胞活化引起的血脑屏障功能障碍的改善。方法将神经小胶质细胞BV-2与小鼠脑血管内皮细胞bEnd.3共培养,建立血脑屏障细胞模型。跨内皮电阻实验和细胞渗漏实验检测内皮细胞屏障的损伤情况;酶联免疫吸附法测定BV2细胞上清中TNF-α的含量;免疫印迹法检测bEnd.3细胞中紧密连接蛋白,包括occludin、claudin1、claudin5和claudin19的表达。结果用高糖诱导活化BV-2细胞或用TNF-α直接刺激bEnd.3细胞都会损伤bEnd.3细胞构成的细胞屏障,野黄芩素可逆转这种损伤。野黄芩素可以减少高糖诱导活化的BV-2细胞中TNF-α的分泌。TNF-α可以降低bEnd.3细胞中紧密连接蛋白claudin1、claudin5和claudin19的表达,野黄芩素能够逆转TNF-α降低的claudin1和claudin19蛋白表达。结论野黄芩素可以阻断高糖诱导的神经小胶质细胞活化,减少炎性因子TNF-α的释放,缓解高糖诱导激活神经小胶质细胞和TNF-α直接刺激脑血管内皮细胞所导致的血脑屏障破损。

野黄芩素的合成与表征

本文以3,4,5-三甲氧基苯酚与对甲氧基肉桂酰氯为原料,在三氟化硼-乙醚络合物催化下,发生Friedel–Crafts反应,生成9-羟基-5,6,7,4'–四甲氧基查尔酮;然后9-羟基-5,6,7,4'–四甲氧基查尔酮在碘的二甲基亚砜溶液中发生分子内环合得到5,6,7,4'-四甲氧基黄酮;最后在酸性条件下,5,6,7,4'-四甲氧基黄酮发生去甲基化水解反应制得野黄芩素,总产率达到54%。化合物结构经IR,1H NMR和MS表征。该方法简单易行,具有广泛的应用前景。