量子点免疫荧光原位杂交法检测宫颈癌组织芯片中高危型HPV的感染状况

目的研究宫颈癌及相关组织高危型HPV的感染状况,并评价所用检测方法的特异性和敏感性。方法回顾性采集124例石蜡包埋宫颈(癌)组织,包括80例宫颈鳞状细胞癌,24例宫颈腺癌,以及20例因子宫肌瘤或子宫腺肌病等原因切除的正常宫颈组织或炎性宫颈组织。收集宫颈癌实验标本及建立宫颈癌临床病理信息库;标本分组并按要求制作切片(含白片、HE切片及组织芯片制作)。最后应用量子点免疫荧光原位杂交技术(QDs-FISH)检测高危型HPV。结果 QDs-FISH结合biotin-labeled DNA探针检测宫颈(癌)组织,显示HrHPV阳性信号位于肿瘤细胞胞核。在正常宫颈组织中未见Hr-HPV阳性表达;80例宫颈鳞状细胞癌细胞有67例阳性表达,占83.75%;24例腺癌标本有18例阳性表达,占66.66%。Hr-HPV仅在癌组织中高表达,与正常宫颈组织相比,差异有统计学意义(P<0.05);而鳞状细胞癌与腺癌组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 (1)Hr-HPV感染与宫颈癌的发生发展密切相关。(2)QDs-FISH方法取材方便,依从性好,有较高的敏感性和特异性,重复性好,检测设备也易于操作,可作为筛查宫颈癌的一种较好方法。

量子点标记荧光原位杂交法在快速检测金黄色葡萄球菌中的应用

目的:应用量子点标记的荧光原位杂交方法以快速检测金黄色葡萄球菌。方法:采用两种量子点-亲和素-生物素-DNA探针,即A型肠毒素(SEA)基因与FemB基因探针与金黄色葡萄球菌临床分离株或感染金黄色葡萄球菌的粪便标本进行荧光原位杂交,同时与SEA基因聚合酶链反应(PCR)的检测结果比较。结果:10株临床金黄色葡萄球菌分离株中,2株SEA基因探针杂交和SEA基因PCR检测结果均为阳性,其余8株SEA基因探针杂交和SEA基因PCR检测结果均为阴性,10株FemB基因探针杂交结果均为阳性。3例分离培养为金黄色葡萄球菌的临床粪便标本直接进行荧光原位杂交,FemB及SEA基因探针杂交结果均为阳性,SEA基因PCR检测结果均为阳性。SEA、FemB基因探针与其他相关菌种未见非特异性反应。结论:量子点标记荧光原位杂交法检测金黄色葡萄球菌具有快速、简便、特异的特点,且可用于临床粪便标本的直接检测。

口腔鳞癌细胞中bcl-2、bax的量子点双标免疫荧光成像研究

目的:利用量子点对口腔鳞癌细胞内bcl-2、bax蛋白进行双标免疫荧光成像研究。方法:利用量子点QD605和QD545通过双标免疫荧光法,在激光共聚焦显微镜下对人舌癌Tca8113细胞内bcl-2、bax蛋白同时观察识别。结果:不同粒径量子点可同时对舌癌细胞bcl-2、bax蛋白特异性识别,在激光共聚焦显微镜下观察到舌癌细胞bcl-2和bax蛋白高表达。QD605标记的bcl-2蛋白表现为红色荧光,QD545标记的bax蛋白表现为绿色荧光,2种蛋白在细胞内同一位置重叠呈现黄色荧光。激光连续照射1 h,3种颜色的荧光均未明显衰减。结论:量子点能同时对细胞内的2种蛋白进行双标免疫荧光成像。

水溶性CdTe量子点-广谱抗细胞角蛋白单克隆抗体荧光探针的制备及其对肝癌细胞HepG2的免疫荧光标记

目的制备水溶性CdTe量子点-广谱抗细胞角蛋白单克隆抗体(QDs-MAb)荧光探针,并对其特异免疫性识别能力和荧光稳定性进行检测。方法在EDC偶联剂的作用下,将水溶性CdTe量子点与广谱细胞角蛋白单克隆抗体(PanCK)进行了连接;对肝癌细胞HepG2采用免疫细胞化学法和QDs-MAb单抗荧光探针直接免疫荧光标记法观察比较PanCK蛋白在细胞内的分布;将量子点与传统的荧光染料FITC的荧光强度和荧光稳定性进行了比较。结果QDs-MAb单抗荧光探针对HepG2细胞内的PanCK分子具有特异性的识别能力;与FITC相比,QDs-MAb荧光探针荧光度更强,光化学稳定性更好,激发光连续照射30min及室温放置3d后均未见明显淬灭。结论本实验成功制备了QDs-MAb荧光探针,为半导体量子点用于上皮来源的肿瘤细胞内PanCK分子的相关检测提供了科学依据。

量子点免疫荧光技术在病理诊断中的初步应用

目的利用量子点(quantum dots,QDs)免疫荧光技术检测石蜡包埋组织中不同蛋白的定位与免疫酶法进行比较,以及两种蛋白的共表达,并探讨其初步应用价值。方法利用QDs免疫荧光和免疫酶组织化学方法分别检测正常阑尾组织LCA、乳腺肌上皮组织Calponin、肺癌组织p53蛋白的表达,并利用QDs免疫荧光双标法同时检测了宫颈上皮内瘤变组织内CK和PCNA蛋白、乳腺癌组织内Her-2和CK蛋白的共表达。结果QDs免疫荧光和免疫酶组织化学技术分别检测LCA、Calponin和p53蛋白的定位完全一致。QDs免疫荧光双标法结合多光谱成像可同时观察到宫颈上皮内瘤变组织内CK和PCNA蛋白、乳腺癌组织内Her-2和CK蛋白的共表达。结论QDs免疫荧光组织化学法具有与免疫酶法等同的应用价值。QDs免疫荧光双标法可同时检测不同蛋白的共定位。

量子点免疫荧光技术检测乳腺癌中端粒酶的表达和增殖的关系

目的研究乳腺癌组织中端粒酶和PCNA的蛋白表达及其临床病理学意义。方法采用量子点免疫荧光组织化学方法检测乳腺癌组织芯片中端粒酶和PCNA蛋白的表达情况。结果乳腺癌和非癌变乳腺组织相比，端粒酶和PCNA蛋白的表达差异均有显著性（P〈0．05）。其中端粒酶的阳性表达率与高的病理分级（x2=4．419，P=-0．041）、高的TNM分期（x2=6．4315，P=-0．012）均呈显著正相关，并与淋巴结转移也呈正相关（x2=7．783，P=-0．005）。PCNA表达在病理分级的Ⅲ级组明显高于Ⅰ～Ⅱ级组，差异具有显著性（x2=10．606，P=0．001）；淋巴结转移组显著高于未转移组（x2=71636，P=-0．006）。而且在乳腺癌中端粒酶和PCNA的表达呈显著正相关性（r=0．368，P=-0．002）。结论端粒酶与PCNA蛋白表达与乳腺癌的进展相关，且二者有协同作用。

荧光原位杂交技术的研究进展

荧光原位杂交(FISH)是在染色体、间期细胞核和DNA纤维上进行DNA序列定位的一种有效手段。近年来,围绕提高检测的分辨率和灵敏性,不断将免疫染色、量子点和微流控芯片等物理化学技术引入到荧光原位杂交中,促进了它的快速发展。本文主要综述了荧光原位杂交的基本原理和发展历程,重点介绍了免疫染色-荧光原位杂交(immuno-FISH)、量子点-荧光原位杂交(QD-FISH)和微流控芯片-荧光原位杂交(FISH on microchip)等多种新技术及其检测特点,如快速、灵敏、动态、多样化等。随着荧光原位杂交技术的不断完善与发展,将在细胞遗传学、表观遗传学及分子生物学等领域发挥更加重要的作用。

样品放置周期对量子点免疫荧光法胃幽门螺旋杆菌分型检测的影响

探讨不同不同样品放置周期对胃幽门螺旋杆菌分型检测结果的影响状况,从而为基层社区卫生服务中心制定适宜的胃幽门螺旋杆菌分型检测检测周期提供循证学依据。方法:以门诊确诊感染Hp的158例胃肠疾病患者以及163列排除感染Hp的门诊正常人群为对照组作为研究对象,用量子点免疫荧光法分别对新鲜血清标本(4小时内)、4℃放置三天、4℃放置一周的血清标本分别进行胃幽门螺旋杆菌分型检测,分析相应的Hp细胞毒素相关蛋白(CagA)、空泡毒素(VacA)、尿素酶抗体(Urease)检测结果的差异。结论:样品放置3天以内对样品检测结果影响不大、没有表现出明显的差异,放置7天以上对检测结果影响较大表现出明显的差异(p﹤0.05)。

量子点标记链霉亲和素荧光免疫分析金黄葡萄球菌

量子点（Quantum Dots，QD），又称半导体纳米晶体，能够接受激发产生荧光，因此，实际上是一种探针。目前，在生物学领域QD应用较多的是Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的纳米微粒嘲。链霉亲和素（streptavidin，SA）又称链霉抗生物素蛋白，具有高度的亲和力，其功能类似亲和素。

量子点荧光技术标记口腔鳞癌细胞中bcl-2的研究

【目的】利用量子点(QD)优良的光学性质对人舌癌Tca8113细胞内bcl-2进行特异性荧光标记,并与异硫氰酸荧光素(FITC)进行光稳定性比较。【方法】分别利用QD605nm和FITC,通过间接免疫荧光法,在激光共聚焦显微镜下观测人舌癌Tca8113细胞内bcl-2的表达,并激光连续照射1h,用激光共聚焦显微镜自带软件Leica Confocal Software测量量子点QD605nm和FITC的荧光信号强度。【结果】激光共聚焦显微镜下可见人舌癌Tca8113细胞内bcl-2明显表达,量子点QD605标记的荧光信号比FITC更具特异性,且激光连续照射1h,QD605nm标记的荧光未见明显衰减,而FITC标记的荧光1h内已基本淬灭。【结论】量子点荧光标记技术能对细胞内bcl-2进行标记,比传统的有机荧光具有更显著的优点。

量子点荧光探针在人舌鳞状细胞癌组织中的应用研究

目的通过免疫荧光技术,利用量子点荧光探针在人的舌鳞状细胞癌组织中检测特定蛋白,探讨量子点荧光探针在人舌鳞状细胞癌组织中的应用。方法相同粒径的量子点通过间接免疫荧光技术分别对人舌鳞状细胞癌组织中的P53及Bcl-2蛋白进行特异荧光标记,荧光显微镜观察蛋白定位表达;不同粒径的量子点通过间接免疫荧光技术,在同一张舌鳞状细胞癌组织切片上分别标记P53蛋白与Bcl-2蛋白,并对其定位表达进行观察。结果相同粒径的量子点荧光探针可分别与组织中的P53、Bcl-2蛋白结合,在紫外荧光激发下发出特异红色荧光,P53蛋白结合物主要分布于细胞核;Bcl-2蛋白结合物主要分布于细胞质;不同粒径的量子点荧光探针在同一张组织切片上可同时对P53蛋白与Bcl-2蛋白进行标记,在紫外荧光激发下2种蛋白结合物发出2种不同颜色的荧光形成鲜明对比,显示量子点荧光探针标记的蛋白定位准确,特异性高。结论量子点荧光探针可应用于人舌鳞状细胞癌组织中的2种蛋白的特异免疫荧光标记。

半导体量子点-Smad2单克隆抗体荧光探针的制备及其相关性质检测

目的制备半导体量子点-Smad2单克隆抗体荧光探针(QDs-Smad2单抗荧光探针),并对其相关光学性质和特异免疫性识别能力进行检测。方法1)用半导体量子点和Smad2单克隆抗体通过化学偶联法制备水溶性的QDs-Smad2单抗荧光探针并纯化;2)用紫外分光光度计和荧光分光光度计分别测定QDs-Smad2单抗荧光探针的吸收光谱、发射光谱,在激光共聚焦显微镜下观察并检测QDs-Smad2单抗荧光探针的形态、荧光强度和光化学稳定性;3)转化生长因子-β1(TGF-β1)和大鼠牙乳头细胞共同孵育24h后,采用SP免疫细胞化学法和QDs-Smad2单抗荧光探针直接免疫荧光成像法观察比较Smad2信号蛋白分子在大鼠牙乳头细胞内的分布,并检测细胞内QDs-Smad2单抗荧光探针的相关光学性质。结果半导体量子点与Smad2单抗通过共价结合形成稳定的QDs-Smad2单抗荧光探针,QDs-Smad2单抗荧光探针对大鼠牙乳头细胞内Smad2分子具有特异性的识别能力;QDs-Smad2单抗荧光探针仍具有QDs所具有的激发光谱宽,发射光谱窄,荧光度强,光化学稳定性好等优良光学特征。结论生物修饰的半导体量子点和单克隆抗体通过共价结合形成纳米分子探针后仍具有特异免疫识别能力和量子点独特的光学性质,这为半导体量子点用于活细胞内对蛋白质分子进行实时、原位、长时间动态可视化检测提供了科学基础和依据。

量子点多重荧光染色技术在肿瘤标志物检测中应用的研究进展

纳米技术在恶性肿瘤检测和诊断中已有广阔的应用前景。新型荧光半导体纳米晶体量子点具有荧光强度高、稳定性好和发射光谱可调等理化特性,经生物分子修饰后,可与肿瘤标志物结合,用于同时检测多种肿瘤标志物。

应用量子点荧光探针检测裸鼠舌癌组织中bcl-2表达

目的探讨应用量子点荧光探针检测裸鼠舌鳞癌移植瘤组织中bcl-2蛋白的可行性及其研究价值。方法 10只BALB/c-nu裸鼠皮下接种舌鳞癌Tca8113细胞悬液,待瘤体长至约1cm3时处死裸鼠,取瘤组织制成石蜡包埋组织切片和冰冻切片,经病理诊断证实为瘤组织后,应用量子点荧光探针通过间接免疫荧光法标记,在荧光显微镜下观察组织切片中的bcl-2蛋白,并与免疫组织化学检测的bcl-2蛋白进行比较。结果量子点荧光探针可分别与石蜡和冰冻组织切片中的bcl-2蛋白结合,在紫外荧光激发下发出特定荧光,主要分布于细胞浆,与免疫组织化学检测的bcl-2蛋白定位相同。结论量子点荧光探针可应用于裸鼠舌鳞癌移植瘤组织中检测特定蛋白。

两种粒径量子点在人舌鳞癌细胞中双色荧光成像的应用研究

目的研究粒径655 nm和525 nm的两种量子点(quantum dots,QDs)对人舌癌Tca8113细胞内2种热休克蛋白(heat shock protein,HSP)进行特异性荧光标记的成像效果和稳定性,为今后的连续动态观察提供实验依据。方法利用QD655nm和QD525nm,对人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白进行特异性双重荧光标记,激光连续照射2 420 391 ms,在共聚焦显微镜下同时观测人舌癌Tca8113细胞内的HSP90蛋白和HSP70蛋白表达及分布,用软件Leica Confocal Software测量量子点QD655nm和QD525nm的荧光信号强度变化。结果激光共聚焦显微镜下可见人舌癌Tca8113细胞内HSP90蛋白和HSP70蛋白均有明显表达,分别表现为红色和绿色荧光,两种蛋白重叠处呈黄色荧光,在激光连续照射中,两种荧光有所衰减,其中QD655nm的荧光强度值下降相对较快、幅度相对较大。结论量子点荧光标记技术能同时对人舌鳞癌细胞中HSP90蛋白和HSP70蛋白进行双重标记,而且QD655nm与QD525nm都具有较强的光稳定性,均可用于蛋白的长时间动态监测,其中QD525nm的稳定性更好。

两种猪肺炎支原体原位杂交检测方法的应用

为了比较研究3种猪肺炎支原体(Mhp)的检测方法,利用已建立的显色原位杂交(CISH)和量子点荧光原位杂交(QD-FISH),并结合PCR方法,检测人工感染Mhp的试验猪、自然感染Mhp的试验猪和疑似感染Mhp的临床样品。结果显示,3种检测方法对人工感染组和自然感染组的检测率均为100%;对临床样品,PCR的检测率为90%,CISH的检测率为70%,QD-FISH的检测率为75%。结果表明,用于检测Mhp感染,PCR是最佳检测方法,但CISH和QD-FISH在Mhp检测和致病机理研究方面具有一定的应用价值。

量子点联合Cy5双重荧光标记人舌鳞状细胞癌细胞蛋白质的应用研究

目的比较以量子点(quantum dots,QDs)与Cy5荧光染料对人舌鳞癌细胞株Tca8113细胞中热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记时蛋白质的分布及荧光的稳定性。方法以QDs和Cy5荧光染料对Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质进行双重免疫荧光标记,在激光共聚焦显微镜下同时观察Tca8113细胞内的HSP70和survivin蛋白质表达及分布。激光连续照射2 420 391 ms,用激光共聚焦显微镜自带软件Leica Confocal Software测量QDs和Cy5的荧光信号强度变化。结果激光共聚焦显微镜下可见Tca8113细胞内HSP70和survivin蛋白质均有明显表达,分别表现为绿色和红色荧光,其中两种蛋白质重叠处呈黄色荧光。激光连续照射2 420 391 ms,QDs标记的绿色荧光未见明显衰减,而Cy5荧光染料标记的红色荧光基本淬灭,随着Cy5荧光的淬灭,绿红黄三色通道下所见的红绿黄3种颜色的荧光也逐渐消退直至变成单色的绿色荧光。结论 QDs对光漂白的抵抗能力强,比Cy5荧光染料具有更高的光稳定性,更加适用于细胞内蛋白质的长时间动态监测的研究。

基于量子点荧光探针的高灵敏蛋白质检测方法

通过制备量子点荧光检测探针，构建了一种基于量子点探针和免疫磁珠的蛋白质检测方法，实现了对蛋白肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，cEA）的高灵敏定量检测．在该检测体系中，若存在有靶标蛋白，其与量子点检测探针以及捕获探针之间会发生免疫反应形成三明治结构，利用磁力分离器对免疫复合物进行富集后，通过检测富集在磁珠表面的量子点荧光信号，可实现对靶标蛋白的定量．该方法的检测灵敏度为38pg／mL，线性范围为0．39～50ng／mL，临床质控样本检验结果表明，该方法准确度高，可重复性好，可应用于临床样本检测．该量子点探针检测体系具有灵敏度高、特异性好、样品消耗量低等优点，在疾病早期诊断方面具有广阔的应用前景．

量子点荧光技术标记口腔鳞癌细胞中bax的应用研究

目的利用量子点(QD)优良的光学性质对人舌癌Tca8113细胞内bax进行特异性荧光标记。方法利用QD545nm通过间接免疫荧光法,在激光共聚焦显微镜下观测人舌癌Tca8113细胞内bax的表达,并激光连续照射1 h,用激光共聚焦显微镜自带软件Leica Confocal Software测量量子点QD545nm的荧光信号强度。结果激光共聚焦显微镜下可见人舌癌Tca8113细胞内bax明显表达,且激光连续照射1 h,QD545nm标记的荧光未见明显衰减,而FITC标记的荧光1 h内已基本淬灭。结论量子点荧光标记技术能对细胞内bax进行标记。

谷胱甘肽包被的CdSe/CdS量子点的直接水相制备及其对人血淋巴细胞的标记成像

首次用谷胱甘肽(GSH)作为稳定剂,在水溶液中制备了稳定地发射绿色荧光和橙色荧光的两种CdSe/CdS核/壳结构的纳米量子点。用紫外-可见分光光度和荧光光谱方法研究了CdSe/CdS量子点的发光特性。透射电镜(TEM)结果表明CdSe/CdS量子点近似球形,在水中分散性良好,比CdSe量子点具有更优异的发光特性,发射光谱和吸收光谱都有红移现象。将CdSe/CdS量子点与鼠抗人CD3抗体连接,制备了水溶性CdSe/CdS-CD3复合物探针,对人血淋巴细胞进行标记和成像。结果表明用该探针对人血淋巴细胞成像清晰,其荧光在30 min的连续蓝光激发下无明显衰退,而FITC荧光在20 min内基本完全猝灭。