携带新德里金属β-内酰胺酶的猪源大肠杆菌全基因组测序及植物提取物药物筛选

为了解大肠杆菌携带新德里金属β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase,NDM)NDM耐药基因情况及筛选敏感植物提取物。采用16S rRNA菌种鉴定,PCR筛查菌耐药基因,bla NDM、bla TEM和AmpC酶耐药基因的确认,全基因组测序,BLAST和MEGA软件对序列进行生物信息学分析、系统进化树分析、NDM亚型鉴定和6种植物提取物药敏药物筛选研究。结果表明,从2021年(1-12月)临床猪腹泻病例中分离鉴定的91株大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)中鉴定出1株同时携带新德里金属β-内酰胺酶NDM4、NDM5和β内酰胺酶blaTEM、AmpC酶的大肠杆菌(HN2187)。对其进行11种抗生素和6种植物提取物药物敏感性测试,结果显示HN2187菌株对其均耐药。而HN2187对血根碱、贯叶连翘提取物敏感,对黄芩、姜黄素、千里光和大蒜提取物耐药。HN2187产B类酶,携带NDM4、NDM5、bla TEM、AmpC酶耐药基因,其中bla NDM-4位于质粒pNDM4-HN2187(Plasmid B)上,bla NDM-5位于质粒pNDM5-HN2187(Plasmid A)上,bla TEM1位于质粒pTEM1-HN2187(Plasmid B)上,AmpC酶耐药基因位于染色体上,分别介导bla NDM-4、bla NDM-5、bla TEM和AmpC耐药基因,是耐药菌传播的重要载体。以上研究表明,携带NDM4和NDM5的多重耐药菌已在养殖场传播和流行,应加强该类耐药基因的流行调查、监测和新药物研究,为临床超级细菌和多重耐药菌感染的流行和防治提供理论基础。

多光谱方法结合理论计算探究金属β-内酰胺酶SMB-1与亚胺培南之间的相互作用

金属β-内酰胺酶(MβLs)可以水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素,这是导致细菌感染治疗中产生耐药性的主要机制。迄今为止,由于缺乏临床批准的抑制剂,这已成为全球关注的问题。最近来自粘质沙雷氏菌的SMB-1被发现是一种新型的B3亚类MβL,它可以灭活几乎所有含β-内酰胺环的抗生素。为了明确SMB-1与β-内酰胺类抗生素的特异性分子识别和作用机制,采用内源性荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱及分子对接方法对碳青霉烯类抗生素亚胺培南(IMIP)与金属β-内酰胺酶SMB-1之间的相互作用机制进行探究。猝灭光谱结果表明IMIP可以使SMB-1内源性荧光猝灭,且猝灭机制为动态和静态组合猝灭,其中静态猝灭为主,结合常数K a为16.11×10^(3)L·mol^(-1)(277 K),表明两者之间具有很强的结合力;根据Van’t Hoff方程得出结合过程中的热力学参数ΔG<0,ΔH=-79.65 kJ·mol^(-1),ΔS=-238.69 J·mol^(-1),说明两者的结合是由焓变和熵变共同驱动的,且氢键和范德华力为主要作用力;同步荧光结果中,随着IMIP浓度的增加,SMB-1最大发射波长均发生蓝移4.4和2.9 nm,表明Tyr和Trp残基参与IMIP与SMB-1的结合过程;三维荧光光谱中IMIP加入后,SMB-1的Peak B和Peak C强度显著降低,表明SMB-1与IMIP作用之后的微环境和构象发生了改变,与同步荧光结果一致。分子对接结果中IMIP的β-内酰胺环进入SMB-1的结合口袋,而侧链因空间位阻效应位于活性口袋的外部,表明SMB-1主要是识别IMIP的核心结构,与其R2侧链的作用较弱;与IMIP参与作用的氨基酸残基包括Ser175,Thr177,Gln157,His215和Glu217,表明这些氨基酸残基与活性部位的两个锌离子是设计具有强亲和力的SMB-1抑制剂的关键因素;结合自由能也为负值,表明两者的结合是一个自发放热的过程,与荧光结果一致。该研究提供了对SMB-1与IMIP的识别和结合的见解,可能有助于设计β-内酰胺酶新底物和开发对超级细菌具有抗性的新抗生素。

螯合剂类金属β-内酰胺酶抑制剂的研究综述

金属β-内酰胺酶为β-内酰胺酶中的B亚群,如果细菌带有此酶,即会对青霉素类、碳青霉烯类以及头孢菌素类抗生素产生耐药性,细菌产生耐药性并发生转移,导致出现自然界中的细菌出现广泛耐药,单一品种的抗生素难以达到原有效果。螯合剂类金属β-内酰胺酶抑制剂,是与金属酶活性中心Zn2+离子结合或者螯合,从而抑制金属β-内酰胺酶活性。本文在针对金属β-内酰胺酶分类及其分子结构实施分析基础上,综述几种螯合剂类金属β-内酰胺酶抑制剂,以为之后螯合剂类金属β-内酰胺酶抑制剂的研究以及开发提供相关依据。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性与金属β-内酰胺酶的关系

目的了解耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性与金属β-内酰胺酶(MBLs)的关系。方法2-巯基丙酸协同试验筛选产MBLs菌株;PCR扩增和克隆含有MBLs基因的Ⅰ型整合子,Southern印迹分析MBLs基因的定位;随机引物多态性DNA(RAPD)分析分离株的同源性。结果128株亚胺培南耐药株对阿米卡星、头孢他啶和环丙沙星的耐药率(31.9%、43.6%和61.0%),显著高于亚胺培南敏感株(9.8%、13.9%和24.3%)(P<0.01);分别有6株(4.7%)或9株(7.1%)产VIM-2或IMP-1型MBLs;VIM-2基因位于染色体上的Ⅰ型整合子结构,而IMP-1基因位于23kb的质粒上;RAPD显示8株产IMP-1型MBLs菌株有相同的带谱。结论产VIM-2和IMP-1型MBLs铜绿假单胞菌可导致医院感染。

亚胺培南耐药铜绿假单胞菌的金属β-内酰胺酶检测

目的了解金属β-内酰胺酶在广州地区铜绿假单胞菌中的流行状况及其流行亚型,完善广州地区金属β-内酰胺酶的分子流行病学资料。方法采用双纸片协同法和双纸片增效法对164株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌筛选金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株,采用PCR检测5类金属β-内酰胺酶的编码基因(IMP家族、VIM家族、GIM-1、SPM-1和SIM-1),利用生物信息学的方法对检测到的金属β-内酰胺酶亚型进行比对分析并制作分子进化树。结果 164株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌中筛选出22株金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株,IMP阳性15株(9.1%),其中11株为IMP-9亚型,另外4株携带一个新的亚型,命名为IMP-25,VIM阳性5株(3.0%),均为VIM-2亚型,未检测到GIM-1、SPM-1和SIM-1型金属β-内酰胺酶。结论广州地区铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶的基因型已经出现多型化的特征,同时存在IMP型和VIM型金属β-内酰胺酶的流行,本次研究发现了一个新的金属β-内酰胺酶亚型(IMP-25),为IMP家族金属β-内酰胺酶的多样性及其分子流行病学资料提供了新的信息。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性分析及金属β-内酰胺酶检测

目的 了解耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药谱及产金属β-内酰胺酶情况。方法 K-B法测定铜绿假单胞 菌对10种抗菌药物的耐药性;亚胺培南纸片法测定铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶。结果 194株铜绿假单胞 菌中44株(22.9％)对亚胺培南耐药,这44株菌对哌拉西林、头孢他啶、头孢哌酮、左氧氟沙星耐药;对阿米卡星 耐药率相对较低;对头孢哌酮／舒巴坦、头孢吡肟、环丙沙星部分敏感;对亚胺培南耐药的44株铜绿假单胞菌金属 β-内酰胺酶检出率为11.3％。结论 产金属β-内酰胺酶是铜绿假单胞菌对亚胺培南及头孢类抗生素耐药的机制 之一,治疗耐亚胺培南铜绿假单胞菌引起的感染宜参考实验室的细菌药敏结果选用较敏感的四代头孢或环丙沙 星结合头孢哌酮／舒巴坦联合用药;实验室提高对其检出可帮助临床合理选用抗菌药物并减少耐药性的传播。

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD2缺失和金属β-内酰胺酶与亚胺培南耐药的关系

目的了解临床分离耐亚胺培南铜绿假单胞菌中外膜蛋白OprD2的缺失和金属β-内酰胺酶(MBLs)的情况。方法2-巯基丙酸协同试验筛选产MBLs菌株,MBLs序列特异性引物PCR扩增和克隆含MBLs基因,亚胺培南为水解底物测定MBLs活性;Western印迹分析检测亚胺培南耐药株外膜蛋白的表达。结果128株亚胺培南耐药株中有17株(13.3%)产生MBLs,其中有7株(5.4%)和10株(7.8%)分别产VIM-2和IMP-1型MBLs,β-内酰胺酶活性测定显示这些菌株产生的β-内酰胺酶可水解亚胺培南,其水解活性可被EDTA所抑制;实时定量RT-PCR和Western印迹分析检测显示,106株(83.3%)表现为外膜蛋白OprD2的表达缺失,10株(7.8%)表现为外膜蛋白OprD2的表达降低,其余12株(9.3%)的OprD2的表达正常。结论临床分离对耐亚胺培南铜绿假单胞菌大多存在外膜蛋白OprD2的表达缺失或降低,产生VIM-2和IMP-1型MBLs菌株在本地区有一定的流行。

产金属β-内酰胺酶嗜麦芽寡养单胞菌的研究

目的探讨嗜麦芽寡养单胞菌所产金属β-内酰胺酶的酶学特性及分子生物学特征。方法采用纸片协同法筛选产金属β-内酰胺酶菌株;测定产酶株所产β-内酰胺酶对亚胺培南的稳定性和丝氨酸β-内酰胺酶、金属β-内酰胺酶抑制剂的抑酶保护效应;检测金属β-内酰胺酶的等电点;用PCR法检测金属β-内酰胺酶全基因,并测序。结果纸片协同法筛选产金属β-内酰胺酶菌株4株,药敏试验显示对多种抗菌药物耐药。酶稳定性试验显示,4株产酶菌产碳青霉烯水解酶。酶抑制试验表明,克拉维酸对这4株菌所产酶无抑酶保护效应,而金属β-内酰胺酶抑制剂EDTA对4株菌所产酶有抑制作用,且酶活性能被ZnCl2复活。等电聚焦显示,2株菌(710、750)产的碳青霉烯水解酶pI为6.6,1株菌(603)的pI为6.2,EDTA抑制试验证实均为金属β-内酰胺酶。PCR结果显示,以4株细菌基因组DNA为模板,用所设计的金属β-内酰胺酶全基因引物进行PCR扩增,2株(750,710)扩增结果为阳性,进行序列分析,均为867bp。经GeneBank网上同源性比较,发现与金属酶L1的编码基因blaS(注册号AJ291672.1)的核苷酸序列同源性均为99%。结论嗜麦芽寡养单胞菌710和750号产L1型金属β-内酰胺酶;603号可能产非L1型金属β-内酰胺酶。

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因检测及其与整合子的关系研究

目的了解临床分离铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药特征;调查金属β-内酰胺酶在铜绿假单胞菌的流行状况和基因型以及与整合子之间的关系。方法收集广东省4家三甲医院临床分离的铜绿假单胞菌,采用K-B纸片扩散法进行药敏试验;双纸片协同法和增效法筛选金属β-内酰胺酶表型阳性菌株;设计合成金属β-内酰胺酶和整合子的引物序列进行PCR扩增和测序分析,检测金属β-内酰胺酶基因型并分析其与整合子之间的关系。结果 287株铜绿假单胞菌对11种抗生素的耐药率分别为:亚胺培南(33.80%),美罗培南(33.45%)、头孢他啶(27.87%)、头孢吡肟(36.24%)、庆大霉素(45.30%)、阿米卡星(36.94%)、环丙沙星(33.10%)、左氧氟沙星(37.63%)、氨曲南(47.39%)、哌拉西林(35.19%)、哌拉西林/三唑巴坦(28.57%);多重耐药菌占34.84%(100/287),泛耐药菌株占9.41%(27/287);共有9株铜绿假单胞菌呈金属β-内酰胺酶表型阳性,其中2株产IMP-9型MBL,1株产IMP-25型MBL,4株产VIM-2型MBL;有8株金属β-内酰胺酶表型阳性菌株携带了I类整合子,但只有2株成功扩出可变区,其中1株携带了IMP-9基因。结论铜绿假单胞菌耐药情况严重,本地区铜绿假单胞菌中MBLs的基因型以IMP-9、IMP-25和VIM-2为主;MBLs的基因环境较为复杂,部分MBLs为整合子所携带。

临床分离革兰阴性杆菌耐药性分析及金属β-内酰胺酶检测

目的了解临床标本分离的革兰阴性（G^-）杆菌的耐药性及产金属β-内酰胺酶现状，为临床合理应用抗菌药物提供依据。方法应用MicroScan及TDR-100微生物鉴定系统，结合K-B纸片扩散法对分离菌株进行鉴定和药物敏感性测定；采用双纸片协同法检测金属B一内酰胺酶。结果839株G^-杆菌中，肠杆菌科细菌450株，非发酵菌389株。肠杆菌科以大肠埃希菌为主，占17．52％，其次为肺炎克雷伯菌，占11．80％；非发酵菌以铜绿假单胞菌为主，占24．43％，其次为鲍曼不动杆菌，占8．58％。肠杆菌科细菌对美罗培南耐药率为0～11．8％，而对美洛西林、头孢哌酮、氨苄西林／舒巴坦、复方磺胺甲曙唑及庆大霉素耐药率达41．2％～91．3％；非发酵菌对头孢吡肟和美罗培南耐药率分别为0-20．0％以及0～30．0％，而对美洛西林、复方磺胺甲嗯唑及庆大霉素耐药率达40．0％-93．3％。在耐头孢他啶和／或美罗培南的258株G^-杆菌中，共检出17株（6．59％）金属β-内酰胺酶阳性菌，产该酶菌株对多种抗菌药物耐药。结论临床分离的G^-杆菌耐药已十分严重，并出现产金属β-内酰胺酶菌株；应加强对细菌耐药性监测，防止耐药菌株播散，尤其是产金属β-内酰胺酶菌株感染的暴发。

产吲哚金黄杆菌金属β-内酰胺酶及其基因型检测

目的了解产吲哚金黄杆菌(Chryseobacteriumindologenes)耐药特性和金属β-内酰胺酶(MBL)的产酶率及其基因型。方法琼脂稀释法检测25株产吲哚金黄杆菌的最低抑菌浓度(MIC),增效法、改良三维试验法进行MBL表型检测,聚合酶链反应(PCR)筛查MBL和整合酶基因,全编码基因检测以及序列分析以确定IND型MBL的基因型;接合试验监测耐药基因是否具有可转移性,等电聚焦电泳(IEF)测定β-内酰胺酶等电点(pI)。结果产吲哚金黄杆菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率为88.0%,但利福平、加替沙星、左氧氟沙星的耐药率均<12.0%;表型检测19株细菌产MBL,PCR初筛检测仅IND-like通用引物扩增出20株阳性,全编码基因分析,blaIND-1型9株,blaIND-2型10株,IND-like型MBL基因1株,其中5株blaIND碱基序列和演绎的氨基酸序列均发生改变;接合试验均为阴性,19株检测到1(17株)或2个(2株)pI值,携带blaIND-1的菌株(CI-5)经IEF和MBL表型检测均为阴性。结论产吲哚金黄杆菌具有很高的MBL检出率,本地区的产吲哚金黄杆菌以产IND-1、IND-2型MBL为主,blaIND可能存在蛋白质的不表达或低水平表达。

259株铜绿假单胞菌耐药性及产金属β-内酰胺酶情况分析

目的分析院内感染铜绿假单胞菌的药敏谱和金属β-内酰胺酶的产生情况。方法对2009年度医院内感染铜绿假单胞菌259株,用VITEK 2 compact全自动微生物分析系统检测其对17种抗生素的药敏谱,用双纸片协同试验检测金属β-内酰胺酶。结果铜绿假单胞菌对AMP、FTN、CTT、SAM等耐药率较高,对TOB、AMK、GEN、TZP等较敏感;金属β-内酰胺酶携带率为5.0%,产酶菌株耐药情况严重。结论结合细菌药敏谱慎用碳青霉烯类,合理利用抗生素,对治愈铜绿假单胞菌引起的感染及控制产金属β-内酰胺酶菌株的流行具有重要意义。

耐亚胺培南细菌金属β-内酰胺酶IMP基因的检测

目的 :探讨并建立金属 β 内酰胺酶IMP基因的PCR方法。 方法 :临床分离的病原菌用全自动微生物分析系统鉴定 ,纸片扩散法进行抗生素敏感试验 ,采用 2 巯基丙酸络合金属离子的纸片扩散法来检测金属酶表型 ,PCR法检测金属酶IMP基因。结果 :2 7株耐亚胺培南细菌金属酶表型共检出产金属酶菌株 8株 ,其中铜绿假单胞菌 7株、嗜麦芽窄食单胞菌 1株 ;7株表型产金属酶铜绿假单胞菌IMP基因扩增阳性 ,其他扩增均阴性。结论 :该方法是一种灵敏度高。

获得性金属β-内酰胺酶初筛方法的研究

目的 探讨并建立适用于临床微生物实验室常规初筛检测获得性金属 β 内酰胺酶 (MBL)的实验方法 ,为监控产酶株的流行及指导临床合理选择抗生素提供依据。方法 以EDTA和巯基乳酸 (TLA)为MBL的抑制剂 ,以亚胺培南 (IPM)和头孢他啶 (CAZ)为MBL的底物 ,采用纸片协同法和复合纸片法作MBL初筛试验 ,将几种初筛试验的结果与聚合酶链反应 (PCR)的结果进行比较分析。结果 应用PCR法 ,在 10 2株耐IPM和 (或 )CAZ铜绿假单胞菌中检出VIM型MBL阳性株 11株 ,其中 1株经DNA测序证实为VIM 2亚型 ;几种初筛试验中 ,IPM EDTA复合纸片法的阳性预测值 (90 9% )和阴性预测值 (98 9% )最高 ,敏感性 (90 9% )和特异性 (98 9% )都 >90 %。结论 IPM EDTA复合纸片法方法简便、结果可靠 。

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的耐药性分析及金属β-内酰胺酶的检测

目的了解我院鲍曼不动杆菌的耐药性及其产金属β-内酰胺酶(MBLs)的情况。方法采用K-B纸片扩散法测定13种抗菌药物的耐药性;分别用金属螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)和2-巯基丙酸抑制试验测定鲍曼不动杆菌产金属β-内酰胺酶的情况。结果91株鲍曼不动杆菌中有23株对亚胺培南耐药,其仅对阿米卡星和米诺环素耐药率较低,分别为21.7%和26.1%;对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星部分耐药,耐药率分别为52.2%、43.5%和65.2%;对头孢吡肟耐药率非常高(91.3%);对氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、头孢噻肟、头孢他啶、复方磺胺和美罗培南全部耐药;与亚胺培南敏感组比较,除阿米卡星、环丙沙星、米诺环素外,亚胺培南耐药组对其他抗生素的敏感率明显降低、耐药率明显增高(P<0.05)。23株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌金属β-内酰胺酶的检出率为65.2%(15/23)。结论耐亚胺培南不动杆菌的耐药现象非常严重,临床应根据药敏结果合理选用抗生素;金属β-内酰胺酶的产生是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制之一,实验室应加强对产酶菌株的监测。

产IMP-4型金属β-内酰胺酶多药耐药产酸克雷伯菌耐药基因分析

目的了解产IMP-4型获得性金属β-内酰胺酶产酸克雷伯菌耐药基因存在的状况。方法分别采用K-B法、双纸片增效法、Etest法、聚合酶链反应(PCR)及序列分析方法检测其产金属β-内酰胺酶(MBLs)表型及相关的耐药基因。结果多药耐药产酸克雷伯菌除对阿米卡星、多黏菌素B敏感外,对碳青酶烯类、三代、四代头孢菌素、头孢西丁、氟喹诺酮类、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明、阿莫西林/克拉维酸、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、利福平等均耐药;金属β-内酰胺酶基因型别为IMP-4型(blaIMP-4)、intⅠ1、qacEΔ1-sul1、aadA1、AmpC(blaADC)、CTX-M-14基因阳性。结论产酸克雷伯菌的多药耐药与整合子相关,且携带有多种耐药基因。

金属β-内酰胺酶——抗感染治疗面临的新挑战

碳青霉烯类抗生素是当今抗菌谱最广、治疗产 β 内酰胺酶革兰氏阴性杆菌感染疗效最好的 β 内酰胺类抗生素。某些细菌产生的金属 β 内酰胺酶 (metallo β lactamase,简称金属酶 )能水解碳青霉烯 ,导致产酶菌的耐药谱增宽 ,已引起临床重视。其中由染色体编码的金属酶多分布于临床较少见的细菌中 ;而获得性金属酶不仅可分布于铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌中 ,还能够通过质粒、整合子等水平扩散 ,大大增强了播散的能力及对临床的威胁程度。

广州地区产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的流行病学研究

目的调查广州地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌产金属酶的流行情况,以及产酶菌的耐药谱,以期指导临床用药。方法用VITEK-32型全自动细菌分析系统筛选出来自广州4家三甲医院20052007年耐亚胺培南和（或）头孢他啶的铜绿假单胞菌,琼脂糖平皿二倍稀释法测定铜绿假单胞菌对常用抗生素的MIC值,PCR技术检测编码金属酶的IMP、VIM、GIM-1和SPM-1共4种基因型。结果 144株受试菌中PCR检测金属β-内酰胺酶阳性26株,其中扩增IMP型阳性25株,VIM型阳性1株。未检测出GIM-1和SPM-1型金属酶。产金属酶菌株对多种抗生素高度耐药且耐药率明显高于非产金属酶菌株（P〈0.001）。结论本地区中分离产金属酶的铜绿假单胞菌以IMP型为主,对临床常用的多种抗生素具有高度耐药性,且呈水平传播趋势,应加强对产酶株的临床检测和监控。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶和oprD2基因的检测

目的:了解我院临床分离下呼吸道感染的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPA)oprD2基因和金属β-内酰胺酶(MBL)的分子流行病学情况。方法:铜绿假单胞菌的鉴定和药敏采用VITEK-2系统进行药物的最低抑菌浓度(MIC)检测。应用双纸片增效法和聚合酶链反应(PCR)方法检测其产MBL的表型及相关的oprD2基因、IMP型和VIM型金属酶基因。结果:157株亚胺培南铜绿假单胞菌对多种抗菌药物的耐药率均在40%以上,经双纸片增效法筛选出20株MBL阳性(12.7%),经PCR方法检测20株MBL阳性株中有13株IMP型基因阳性,oprD2基因有67株阳性,其余90株缺失(57.3%),未发现VIM型基因。有10株IRPA既携带IMP型基因同时又有oprD2基因缺失。结论:我院临床分离下呼吸道感染的耐亚胺培南铜绿假单胞菌呈较严重的多重耐药。IMP型基因是我院IRPA产MBL的主要基因型;oprD2基因缺失可能是铜绿假单胞菌亚胺培南耐药的重要原因之一。