重金属增强核因子与水稻金属硫蛋白基因启动子的结合(英文)

植物金属硫蛋白(metallothioneins,MT)被认为在植物应答重金属胁迫方面发挥了重要作用,但该基因的转录调控机制目前仍不清楚.我们以前的研究初步鉴定出位于-331/-194的水稻MT基因(ricMT)启动子区对于金属激活ricMT的表达是必需的.为了明确-331/-194启动子序列在控制ricMT表达中的作用,本课题开展了该序列与核因子的结合特性研究.从2周龄水稻嫩叶中提取了几乎不含叶绿体污染的细胞核,并制备了核蛋白用于凝胶阻滞实验,发现核因子能够与-331/-194启动子序列特异结合.本研究还进一步考察了重金属对核因子结合活性的影响,发现在结合体系中去除重金属离子,核因子与-331/-194序列的结合能力会丧失,而在结合体系中加入重金属离子,结合能力则会随着外加的离子浓度提高而增强,证明这种结合确实依赖于重金属.这些证据结合以前的结果表明,某些金属响应的核因子可能通过结合-331/-194启动子区域来调控ricMT基因表达.

鲤鱼金属硫蛋白基因启动区功能的研究

以氯霉素乙酰化酶作为报讯基因，利用草鱼肾培养细胞瞬时表达系统，对已克隆的鲤鱼金属硫蛋白（ＭＴ）基因５’调节区１６ｋｂ的序列进行了功能分析。从顺式效应和反式效应研究证明：所克隆的鲤鱼ＭＴ基因５’调节区具有典型ＭＴ启动子的特性。实验发现哺乳动物病毒ＳＶ４０增强子可以加强鱼类ＭＴ启动子的活性，提示在系统进化上鱼类基因不但存在增强子元件，并具有与哺乳动物增强子相似的作用方式，而且作用于增强子的反式效应因子也存在一定的同源性。

虹鳟鱼金属硫蛋白启动子的体外扩增、克隆及其序列分析

以含有虹鳟鱼金属硫蛋白基因的质粒DNA为模板 ,以合成的两段 32个寡聚核苷酸为引物 ,经过PCR扩增 ,合成了 4 33bp的片段 ,把其克隆到pBL -CAT载体中 ,序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的虹鳟鱼金属硫蛋白启动子含有 4 33bp ,含有TATA和CAAT序列 ,与Hong报导的鳟鱼金属硫蛋白启动子的序列比较 ,其核苷酸的同源率为 10 0 %。

基质金属蛋白酶-1启动子基因的单核苷酸多态性及其与牙周病的关系

基质金属蛋白酶-1(MMP-1)与牙用病密切相关。研究表明在基质金属蛋白酶-1启动子-1607bp位点由于鸟嘌呤插入造成的单核苷酸多态性可以促进基质金属蛋白酶-1转录水平和蛋白水平的提高。本文就MMP-1启动子基因的单核苷酸多态性及其与牙周病的相关性作一综述。

基质金属蛋白酶家族基因启动子多态性及其与疾病关系的研究进展

近年来,随着分子生物学的进展,人们对MMP的结构、功能及其在病理生理过程中的作用进行了深入的研究。MMP基因存在许多多态性位点,特别是MMP基因启动子多态性对于调节MMP基因表达水平发挥重要作用,与许多疾病易感性相关。现就近年来MMP家族基因启动子基因多态性及其与疾病关系的研究进展予以综述。

外源金属硫蛋白对奶牛抗热应激调控及SOD基因表达的影响

将28头泌乳奶牛随机分成A、B、C、D4组,分别按每头0(对照)、6.0、12.0和16.0mg剂量静脉注射经生理盐水溶解的Zn-MT,以探讨外源性金属硫蛋白(MT)对奶牛抗热应激的调控作用及其机理.结果表明:B、C和D组的脉搏、呼吸频率及血清MDA含量均显著(P<0.05或P<0.01)低于A组;4%标准乳产量、血液GSH-PX活性、红细胞SOD活性、血清MT含量、奶MT含量及SOD基因表达水平均显著(P<0.05或P<0.01)高于A组;C和D组的上述各项指标又优于(P<0.05或P>0.05)B组;外源性MT的调控效果以注射后第30天表达最佳.说明MT是一种能够有效调控奶牛热应激能力的生理活性物质,且在奶牛体内表现出一定的剂量效应和时间效应.

海湾扇贝(Argopecten irradians)金属硫蛋白基因的克隆与分析

金属硫蛋白是一种普遍存在于生物体内的低分子量、半胱氨酸含量丰富、易于被外界刺激诱导的金属结合蛋白。采用表达序列标签法,结合cDNA末端快速扩增技术,首次获得了海湾扇贝金属硫蛋白(AiMT)的全长cDNA序列。该序列全长787bp,5′UTR(UntranslatedRegion)为79bp,3′UTR为270bp,开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)长度为438bp,可编码145个氨基酸。在其编码的氨基酸序列中半胱氨酸含量丰富,甘氨酸含量也较高,芳香族氨基酸含量低,不含组氨酸,存在有无脊椎动物和软体动物金属硫蛋白的特征序列CKCXXX-CXCX,C-末端的氨基酸序列也符合软体动物金属硫蛋白标签序列C-x-C-x(3)-C-T-G-x(3)-C-x-C-x(3)-C-x-C-K。序列特征分析表明,该序列具备金属硫蛋白的典型特征,是金属硫蛋白家族的成员。

金属硫蛋白对奶牛血液抗氧化酶GSH-Px和CAT基因表达的影响

为探讨金属硫蛋白(MT)对奶牛抗氧化应激机能的调控效果及其机理,选取24头中国荷斯坦奶牛经产泌乳母牛,随机均分为I、II、III、IV4组,分别按每头0(对照组),4.0,8.0和12.0mg静脉注射Zn-MT。每隔15d逐头采取血样,测定不同剂量的外源性MT和MT不同作用时间对奶牛抗氧化酶GSH-Px和CAT基因表达水平的影响。结果表明,补给外源性MT后,3个试验组GSH-Px和CAT基因表达水平都有不同幅度的提高,其中III组和IV组GSH-Px基因表达量分别较对照组有显著(P<0.05)提高。III组CAT基因表达水平显著(P<0.05)高于对照组;IV组CAT基因表达水平又比对照组、II组和III组分别提高了22.88%(P<0.01),17.71%(P<0.05)和7.10%(P>0.05)。而II组GSH-Px和CAT基因表达量与对照组差异均不显著(P>0.05)。从正试期间不同时间看,补给外源性MT后,各组GSH-Px和CAT基因表达水平逐步升高,至30d时达最高,45d时又有下降。尤其是30d时的GSH-Px基因表达水平及15和30d时的CAT基因表达水平均显著(P<0.05)高于第1天。说明外源性MT能有效调控奶牛GSH-Px和CAT基因表达水平,并表现出较为明显的剂量效应和时间效应。

铜、锌离子影响丹参金属硫蛋白MT2基因表达

植物金属硫蛋白在金属离子的储存、运输和代谢及降低重金属离子的毒性等方面起着重要作用。本文研究了Cu2+、Zn2+对丹参毛状根中金属硫蛋白基因表达的影响。以6,7-V为液体培养基,分别以缺乏、正常及原培养基100、500、1000倍的Cu2+、Zn2+处理,采用半定量PCR法检测不同时间点时金属硫蛋基因的表达情况。结果发现Cu2+、Zn2+诱导金属硫蛋基因的表达量分别在100倍处理量时的9h和6d达到峰值。Cu2+、Zn2+能显著诱导丹参金属硫蛋白基因的表达,该基因可能在丹参对铜、锌元素的吸收方面发挥着重要的作用。

金属硫蛋白对热应激奶牛血淋巴细胞凋亡基因和HSP70基因表达的影响

为探讨金属硫蛋白(MT)对热应激奶牛血淋巴细胞凋亡基因和HSP70基因表达的影响及其机理,选取25头中国荷斯坦奶牛经产泌乳母牛,随机均分为A、B、C、D、E 5组,分别按每头0(对照),16.0,24.0,32.0和40.0mg颈静脉注射Zn-MT,于试验第1(注射Zn-MT之前),7和14天逐头采取血样,测定不同剂量的外源性MT对热应激奶牛血淋巴细胞HSP70、Bcl-2、Bax和p53基因表达水平的影响。结果表明,补给外源性MT后,4个试验组奶牛的产奶性能都有不同程度提高,其中B组奶牛的产奶量比A、C、D和E组分别高出20.94%(P<0.05),15.83%(P>0.05),10.94%(P>0.05)和8.85%(P>0.05);各试验组HSP70基因的表达水平都有所上升,其中D组比对照组高出130.00%,达到显著(P<0.05)水平;各试验组Bcl-2基因的表达水平均高于对照组,其中C组达到显著(P<0.05)水平;B、D组Bax基因的表达水平和C、E组p53基因的表达水平较对照组分别降低了22.00%,13.00%和22.00%,34.00%,但均未达到显著(P>0.05)水平。说明外源性MT能改善热应激奶牛的产奶性能并有效调控奶牛血淋巴细胞HSP70、Bcl-2、Bax和p53基因的表达水平,且表现出较为明显的剂量效应。

转金属硫蛋白基因(MT_1)烟草耐NaCl胁迫能力

为明确柽柳(Tamarix sp.)金属硫蛋白(MT1)基因过量表达对提高植物耐NaCl能力的作用,对转MT1因烟草进行分子检测和生理特性分析,结果表明具有卡那霉素抗性的转基因植株经RT-PCR Southern杂交均表现为阳性,说明外源MT1基因已整合到烟草基因组,并且得到了表达。金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因烟草植株的耐NaCl能力,表现为在含有150mmol/L和300mmol/L NaCl的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株丙二醛(MDA)含量明显低于非转基因株系,而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性比非转基因株系明显增加。

转金属硫蛋白基因(MT_1)烟草抗Cd^(2+)胁迫的生理特性分析

将柽柳(Tamarixsp.)金属硫蛋白基因(MT1,GenBank登录号:AB298390)插入植物表达载体pBI121,取代花椰菜病毒35S启动子下游的gus基因,利用农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导法将MT1导入烟草(Nicotiana tobacum)基因组。对具有卡那霉素抗性,且经PCR-Southern检测和Northern杂交表现阳性的转基因株系进行抗Cd2+分析表明,金属硫蛋白基因的过量表达提高了转基因植株的抗Cd2+能力,在含200μmol L-1和400μmol L-1Cd2+的MS培养基上,转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系;在生理性状上表现为转基因植株MDA含量及POD活性明显低于非转基因株系,叶绿素含量和SOD活性比非转基因株系明显增加。

青蛤(Cyclina sinensis)金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因的克隆与表达分析

利用构建的cDNA文库及高通量测序方法,获得金属硫蛋白及硫氧还蛋白基因全长。结果表明,青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白的cDNA全长分别为776bp和804bp,金属硫蛋白基因编码74个氨基酸,包含7个CXC特征结构;硫氧还蛋白基因编码165氨基酸,包含5个氨基酸构成的活性中心。采用实时定量PCR方法分析了两种基因在Cd2+胁迫下的表达变化,结果显示,金属硫蛋白基因在Cd2+胁迫下6—12hmRNA表达量急剧上升,与对照组有显著性差异(P<0.01)。硫氧还蛋白基因在Cd2+胁迫下mRNA在6h明显升高,在6—24h与对照组出现显著性差异(P<0.05)。说明Cd2+能够诱导青蛤金属硫蛋白和硫氧还蛋白基因表达的时序性升高,二者的转录过程反映了贝类抵御重金属胁迫的分子调控过程。

金属硫蛋白-1与p53基因在燃煤型砷中毒患者口腔黏膜脱落细胞中的表达

目的观察金属硫蛋白-1(MT-1)、p53基因、雌激素受体(ERa)基因和甲胎蛋白(AFP)基因在燃煤型砷中毒患者口腔黏膜脱落细胞中的表达。方法收集贵州省兴仁县燃煤型砷中毒患者及非病区正常人口腔黏膜脱落细胞,提取mRNA,以荧光实时定量PCR(RT-PCR)方法检测与肝硬化及皮肤癌相关的MT-1及p53基因等表达。结果燃煤型砷中毒患者口腔黏膜脱落细胞MT-1基因表达与对照组比较明显减少(0.83±0.15、3.86±0.37),抑癌基因p53明显增加(4.35±2.79、0.90±0.58),ERa基因和AFP基因无变化。结论砷中毒患者口腔黏膜MT-1基因表达减少,抑癌基因p53表达增加,可作为燃煤型砷中毒患者皮肤及肝脏病变监测的敏感指标之一,RT-PCR技术可广泛用于砷中毒的防治、监测和科研。

镉和铜对嗜热四膜虫金属硫蛋白基因的诱导表达

本文在荧光定量PCR优化的基础上,利用该技术考察了不同浓度的重金属镉和铜对嗜热四膜虫金属硫蛋白基因(MTT1)诱导表达的变化规律。结果表明MTT1基因的表达对镉离子的诱导更灵敏,且在一定阈值浓度(≤35.2μmol/L)范围内,镉离子浓度升高会增加MTT1基因表达量,超过该阈值后表达量迅速下降;镉与铜同时诱导时MTT1基因的表达情况与镉单独诱导的类似,但阈值浓度减小为22μmol/L,表明二者的联合毒性为协同作用。镉离子浓度低于22μmol/L时,与铜离子的共同作用会大大增加MTT1基因的表达量,从而增强了四膜虫的解毒能力。

砷化物对人类金属硫蛋白-3cDNA基因表达的影响

目的探讨砷化物对人类正常肝细胞金属硫蛋白MetallothioneinMT-3cDNA基因表达的影响。方法利用SMART方法克隆cDNA基因,生物信息学分析克隆基因的同源性、染色体定位、基因结构和对该基因编码蛋白质进行分析并对该蛋白质进行跨膜信息分析,基因芯片方法检测染砷L-02细胞MT-3基因的表达。结果成功克隆MT-3cDNA基因,经生物信息学分析可知,该基因定位在人16号染色体16q13区段,跨膜信息分析发现MT-3基因编码蛋白质可以穿出生物膜,基因芯片结果证实染砷的人正常肝L-02细胞在染砷早期MT-3基因表达增高。结论该研究发现人类MT-3基因是砷化物作用的一个相关基因,早期参与了砷代谢解毒。

金属硫蛋白基因在长期水砷暴露小鼠肝组织中的表达

目的探讨金属硫蛋白(MT)-1、2在慢性水砷暴露小鼠肝损伤中的作用。方法将健康清洁级雄性昆明种小鼠随机分成对照组和暴露组,对照组给予普通饲料和自来水(可自由饮用);暴露组给予普通饲料和300mg/L的亚砷酸钠溶液(可自由饮用)。在暴露前,采用150mg/L亚砷酸钠溶液以自由饮用的方式喂养暴露组小鼠,17周后小鼠未出现死亡。染毒10个月后,检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活力和球蛋白(Glb)的含量。采用TRIzol-酚-氯仿一步法提取总RNA,采用紫外分光光度法测定RNA在波长为260和280nm时的吸光度值(A260、A280),以A260/A280鉴定RNA的纯度。以实时荧光定量PCR(RT-PCT)技术测定小鼠肝组织中MT-1和MT-2mRNA。并进行肝组织病理学观察。结果对照组小鼠状态良好,毛发光泽;暴露组小鼠毛发粗糙,精神萎靡,动作迟钝,易激惹,进食、进水量明显减少。对照组小鼠体重为(39.10±3.48)g,高于暴露组[(14.00±1.49)g],差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,暴露组小鼠血清中ALT、AST的活力和Glb含量较高,肝组织中MT-1和MT-2mRNA的含量较低,差异均有统计学意义(P<0.05)。肝脏病理检查结果可见,对照组肝组织正常;暴露组肝细胞水样变性,脂肪样变性,气球样变性,肝细胞点状、灶状、碎片状坏死,汇管区可见炎细胞浸润,少许纤维增生。结论MT表达的降低可能是亚砷酸钠肝毒性的一个易感因素。

金属硫蛋白对仔猪抗氧化功能及SOD基因表达的影响

目的用仔猪作模型,研究经锌元素诱导的外源性金属硫蛋白(Zn-MT)对机体抗氧化功能和超氧化物歧化酶(SOD)基因表达的影响.方法选用杜长大杂交仔猪18头,随机分为3组(1,2和3).分别肌肉注射经生理盐水溶解的猪肝Zn-MT0mg/kg(1组),0.8mg/kg(2组),1.6mg/kg(3组),让仔猪运动产生应激.注射MT后3h和6h,分别从每组取3头仔猪屠宰取肝脏,测定肝脏中与抗氧化有关的生化指标,检测肝脏SOD基因表达水平.结果在应激条件下,补充外源性Zn-MT一段时间后,仔猪肝脏SOD,GSH-PX活性显著升高(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05),肝脏抗活性氧和抗超氧阴离子水平也有提高的趋势.在注射Zn-MT后6h,0.8mg/kg,1.6mg/kg组仔猪肝脏SOD基因表达水平比对照组显著提高(P<0.05).0.8mg/kg组和1.6mg/kg组6hSOD基因表达水平比3h显著增加,表明MT对SOD基因表达的诱导与时间和剂量关系密切.结论补充外源性Zn-MT可提高应激机体的抗氧化物酶活性,从而提高机体的抗应激能力.

转金属硫蛋白及其突变体αα基因烟草的T_1代性状分析

转金属硫蛋白ＭＴ及其突变体αα的烟草自交得到Ｔ１代，转基因植株的重金属抗性和除草剂抗性在后代中得到保持。不同的转基因株系在含有除草剂的培养基中萌发时表现出不同的抗性分离比，说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数。两种转基因烟草在含有不同浓度Ｃｄ的培养基中萌发时表现出高的重金属抗性，其中转αα基因烟草对Ｃｄ的抗性优势在Ｔ１代种子萌发实验中更加明显。以ＭＴ ｃＤＮＡ为探针进行ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交，在Ｔ０代和Ｔ１代同时检测到两种转基因烟草外源基因的存在，证明外源基因确实整合到烟草基因组内并稳定传递到后代。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果证明了外源基因在烟草第二代的表达。纯合株系仍需要进一步的筛选。

苹果金属硫蛋白基因MdFjMT2克隆及生物信息学分析

以红富士苹果(Malus domesticaCV Red Fuji)浓红型芽变和其条红母株为试材,构建抑制性差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)文库,差异筛选SSH-cDNA文库,经过大量测序构建成红富士苹果EST序列本地数据库,对本地数据库进行Blastn检索,得到42条金属硫蛋白基因MdFjMT2的cDNA片段,通过序列拼接和逆转录PCR(RT-PCR)方法,获得了红富士苹果金属硫蛋白基因MdFjMT2全长cDNA序列(Gen-bank登录号为HQ730757),该基因全长684bp,其中5′非翻译区97bp,3′非翻译区347bp,编码区(Coding sequence,CDS)为240bp,编码79个氨基酸,推测蛋白分子量为7.7938kDa,理论等电点为4.75。该基因具有金属硫蛋白基因的典型结构域特征,编码的氨基酸序列中含有14个半胱氨酸残基Cys(C),Cys残基的排列特征是以CC、CXC和CXXC集中分布在肽链的N端和C端。系统进化分析表明MdFjMT2与砂梨(Pyrus pyrifo-lia)、苹果(Malus domestica)和小金海棠(M.xiaojinensis)等植物金属硫蛋白具有较近的亲缘关系,与扁桃(Prunus dulcis)、旱柳(Salixmatsudana)、美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)等植物的亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明,MdFjMT2主要位于叶绿体中,没有信号肽,是非跨膜亲水性蛋白,其蛋白质二级结构的主要元件是无规则卷曲,没有功能结构域。这些结果为Md-FjMT2的结构与功能挖掘提供一定的参考。本研究结果有助于研究该基因在苹果着色中的作用,阐明苹果着色的分子机制。