泛素连接酶E4B介导PM20D2、PABPC1和TACO1蛋白质的泛素化验证

泛素连接酶E4B通过U-box基序可将经泛素活化酶(Ubiquitin-activating enzyme, E1)和泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme, E2)传递的泛素(Ubiquitin, UB)标记至底物蛋白质。探究3个蛋白质:金属蛋白酶M20家族蛋白质2(Peptidase M20 domain-containing protein 2,PM20D2)、多腺苷酸结合蛋白质1(Polyadenylate-binding protein 1,PABPC1)、细胞色素C氧化酶Ⅰ翻译激活剂(Translational activator of cytochrome C oxidase Ⅰ,TACO1)是否可被E4B介导泛素化。从HEK293细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以其为模板调取底物基因并构建重组质粒,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化泛素化过程所需的各个相关蛋白质,通过蛋白质体外泛素化实验,对3个蛋白质进行泛素化验证。结果表明3个蛋白质均可以在蛋白质水平被E4B泛素化,证明3个蛋白质都是E4B的底物,为进一步在细胞中研究其泛素化的机理奠定基础。

格列苯脲调控HSP70/p-Akt/MMP-9/COX-2炎性信号通路保护脑缺血再灌注损伤大鼠的神经血管单元

目的探讨磺酰脲类受体1(SUR1)-转化受体电位阳离子通道亚家族M成员4(TRPM4)特异性抑制剂格列苯脲对脑缺血再灌注损伤大鼠神经血管单元的保护作用及其机制。方法采用随机数字表法将120只雄性SD大鼠分为假手术组、模型组及格列苯脲组,每组40只。后2组采用线栓法制备成急性局灶性大脑中动脉闭塞缺血2 h再灌注模型,其中模型组于缺血2 h后给予单次腹腔注射含0.05%二甲基亚砜的生理盐水,格列苯脲组给予单次腹腔注射10 μg/kg格列苯脲(5 μg/mL)。再灌注后8 h时,采用免疫荧光双标染色及Western blotting检测各组大鼠脑组织中SUR1、TRPM4的表达,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)含量。再灌注后24 h时,采用Zea Longa评分法评估各组大鼠的神经功能缺损程度,采用干湿重法检测脑组织含水量,采用伊文思蓝(EB)染色检测血脑屏障通透性,采用尼氏染色检测脑组织中存活神经元数量,采用免疫组化染色检测IgG渗出量及离子钙接头蛋白-1(Iba-1)、环氧化酶-2(COX-2)阳性细胞的表达,采用Western blotting检测热休克蛋白70(HSP70)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)蛋白的表达。结果(1)再灌注后8 h时,与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中SUR1、TRPM4蛋白表达均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且该两种蛋白存在共定位;与模型组比较,格列苯脲组的SUR1、TRPM4蛋白表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠的MMP-9含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,格列苯脲组的MMP-9含量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)再灌注后24 h时,与假手术组比较,模型组大鼠的神经功能缺损评分明显升高,脑组织含水量明显升高,EB渗出量明显升高,IgG渗出量明显升高,尼氏染色阳性神经元数量明显降低,Iba-1、COX-2阳性细胞数量明显升高,HSP70、p-Akt蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,格列苯脲组的神经功能缺损评分明显降低,脑组织含水量明显降低,EB渗出量明显降低,IgG渗出量明显降低,尼氏染色阳性神经元数量明显升高,Iba-1、COX-2阳性细胞数量明显降低,HSP70、p-Akt蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论SUR1-TRPM4在脑缺血再灌注损伤后表达升高,而其抑制剂格列苯脲对脑缺血再灌注损伤诱导的神经元及血脑屏障等神经血管单元损伤具有一定的保护作用,机制可能与调控HSP70/p-Akt/MMP-9/COX-2炎性信号通路有关。