金属螯合亲和色谱固定相合成及应用进展

金属螯合亲和色谱因具有高稳定、强金属螯合性能等优点,在重金属的检测与吸附、蛋白质的识别与鉴定、分离纯化中有着重要的研究价值。自金属螯合亲和色谱概念提出以来,该技术得到了极大的发展与应用。基于目前的研究文献报道,本文综述了金属螯合亲和色谱固定相合成及应用等方面的研究进展。

金属螯合亲和色谱中固定金属与蛋白质的作用

在不同pHNaCl的磷酸缓冲体系 ,比较了牛血清蛋白 (BSA)、核糖核酸酶 (RNase)、细胞色素C(Cyt C)和溶菌酶 (Lys)在IDA裸柱和一些金属螯合柱上的保留特性 ,考察了固定金属对蛋白质保留行为的影响。指出蛋白质在强结合IDA Cu柱上的保留主要受固定金属和蛋白质间配位作用支配。在弱亲和的IDA Ni、IDA Co和IDA Zn柱上的保留主要受静电作用控制 ,配位作用为辅。讨论了金属螯合亲和色谱中影响蛋白质和金属配位的主要因素 :金属离子的电荷和半径、配位原子对中心离子外层d轨道的影响 ,以及蛋白质表面配位的组氨酸数目、离解常数和取向。影响金属螯合配体和蛋白质静电作用的主要因素为溶液的pH和蛋白质的等电点pI。

金属螯合亲和色谱中的疏水作用

通过考察盐溶盐和盐析盐浓度对蛋白质在IDA裸柱和金属螯合柱上保留行为的影响,详细研究了金属螯合色谱中的疏水作用,疏水作用的发生、形成的条件以及不同条件下对蛋白质保留值的贡献。实验结果表明,在高浓度和低浓度的盐溶盐以及低浓度盐析盐中,蛋白质在金属螯合柱上的保留主要受静电和配位作用控制,而疏水作用对蛋白质的保留影响很小。对弱亲和性的金属螯合柱以静电作用为主,其大小可用参数Q表征;对强亲和性的IDA-Cu(Ⅱ)柱以配位作用为主。仅在高浓度的盐析盐中,金属螯合柱才呈现较强的疏水作用,支配蛋白质保留。实验证明,金属螯合色谱中疏水作用主要来自固定相间隔臂中的疏水碳链和盐析盐对蛋白质的增疏作用,利用这种疏水作用有可能改善金属螯合色谱分离的选择性。

纯化组氨酸标签蛋白金属螯合亲和色谱填料的制备与性能

以琼脂糖(agarose)凝胶的珠状产品SepharoseCl-6B为基质,以环氧氯丙烷为活化剂,将天冬氨酸固定在琼脂糖凝胶微球上,在经与溴乙酸修饰后,最终得到含有羧甲基天冬氨酸结构的琼脂糖凝胶微球.以凝胶微球负载的多羧基为配体分别与Co2+及Ni2+配位分别得到两种金属螯合亲和层析介质.依照上述方法制备了具有不同负载羧基含量的色谱介质.以六聚组氨酸融合蛋白为分离样品,研究了所制备的色谱分离介质的分离纯化性能,并与商品化色谱分离介质Agarose-NTA-Ni进行了比较.结果表明,目标介质蛋白结合容量大,与蛋白结合快、易洗脱、选择性高,金属离子不易脱落.

蛋白质在金属螯合亲和色谱中的竞争洗脱

以细胞色素C和溶菌酶为代表,研究了蛋白质在强亲和性金属螯合柱(IDA-Cu(Ⅱ))上的保留行为。考察了竞争剂、缓冲体系对蛋白质在IDA-Cu(Ⅱ)柱上保留值的影响。发现在PBS和NaAc-HAc缓冲体系用咪唑(Imid)和甘氨酸(Gly)作竞争剂,可使蛋白质得到较好分离;在Gly和Imid竞争体系,分别研究了pH值变化对蛋白质在IDA-Cu(Ⅱ)柱上保留值的影响。为使蛋白质在IDA-Cu(Ⅱ)柱上得到有效分离且减少固定金属Cu2+的流失,对Gly体系,最好采用竞争置换和降低pH值相结合的方式进行洗脱。对Imid体系,溶液pH值应控制在6.0为宜,低pH值下蛋白质则不宜被洗脱。结果表明,竞争剂浓度与蛋白质在IDA-Cu(Ⅱ)柱上的保留关系均符合计量置换模型。随着竞争剂浓度的增加,蛋白质的保留值减小。保留因子(k′)的对数与竞争剂浓度倒数(1/[D])的对数具有良好的线性关系,其线性相关系数分别在0.984和0.986以上。

还原型谷胱甘肽的金属螯合亲和色谱纯化

制备了以壳聚糖为载体的金属螯合亲和色谱分离纯化还原型谷胱甘肽(GSH)。研究了pH、铵离子浓度等对GSH洗脱的影响。根据试验结果确定洗脱液为pH4．2、0．02mol／L磷酸盐缓冲液(含0．5mol／LNH_4Cl),所得GSH纯度可达49．8％, 平均提取率为67．9％。

渗透压冲击预处理提高金属螯合亲和色谱纯化IGF-1融合蛋白的效率

目的采用渗透压冲击预处理细菌以提高重组IGF-1融合蛋白纯化中金属螯合亲和色谱的效率。方法采用20%的蔗糖-EDTA缓冲液预处理经诱导表达的大肠杆菌,然后将表达产物经Ni-NTA-琼脂糖亲和色谱柱进行分离,观察蔗糖溶液处理对纯化效果的影响。结果经蔗糖-EDTA缓冲液预处理后Ni-NTA-琼脂糖色谱柱纯化蛋白的产量可以提高约2倍。结论渗透压冲击预处理可以有效提高金属螯合亲和色谱的效率。

蛋白质在固定Zn^(2+)金属螯合亲和色谱中的变性热力学

在15~85℃宽温度范围,研究了蛋白质在固定Zn2+金属螯合色谱系统中的热行为和变性热力学。实验结果表明,蛋白质在色谱过程都有一个固定的热转变温度:核糖核酸酶(RNase)、α-胰凝乳蛋白酶原A(α-Chy)的热转变温度约为55℃,细胞色素C(Cyt-C)和溶菌酶(Lys)约为65℃;,热转变温度的出现标志蛋白质构象发生变化;利用Van′tHoff作图测定了蛋白质在色谱系统热变性时的标准焓变ΔH°和标准熵变ΔS°,提出用标准熵变ΔS°和自由能变ΔG°判断蛋白质构象变化;利用ΔH°-ΔS°的线性关系估算了蛋白质热变性时的补偿温度,鉴定了蛋白质各变体在金属螯合色谱中保留机理的同一性,RNase、Cyt-C、Lys和α-Chy的补偿温度分别为55℃、65.8℃、65.2℃和54.8℃;根据蛋白质热变性时的补偿温度和构象变化熵变Δ(ΔS°)的大小,讨论了蛋白质在阳离子交换色谱和固定Zn的金属螯合色谱体系中的热稳定性。实验证明,在IDA裸柱引入Zn2+后蛋白质在色谱系统中的热稳定性减小,平均补偿温度从65.3℃降低到59.7℃,而构象变化熵变的绝对值大幅度升高。

固定化金属螯合亲和膜色谱柱制备及纯化铜锌超氧化物歧化酶的研究

以大孔纤维素滤纸为基质 ,通过碱处理、环氧活化、偶联亚氨基二乙酸二钠、固定化Cu2 +,装柱后制得固定化金属螯合亲和膜色谱柱。对Cu/Zn SOD粗品进行了纯化研究 ,将其比活从 645U/mL提高到 6882U/mL ,纯化倍数为 1 0 7,蛋白回收率为 92 3% ,活性回收率达 985%。设计了一种解决金属离子泄露问题的方案 ,将Cu2 +泄露量降至 86μg/L。

增强型绿色荧光蛋白的色谱分离和纯化

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是生物领域常用的标记物。在前期成功克隆表达EGFP的基础上,本实验建立了两步分离纯化EGFP的色谱方法,并验证其分离纯化效果,检验EGFP的活性。首先用金属螯合亲和色谱柱His-Trap HP对EGFP的重组菌体破碎上清液进行初步分离,再用葡聚糖凝胶排阻色谱柱Sephadex G-10 HR对其进行脱盐纯化。采用丙烯葡聚糖凝胶排阻色谱柱Sephacryl S-300 HR和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测分离纯化后的EGFP纯度。最后通过荧光分光检测器和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)验证分离纯化后的EGFP是否具有荧光活性。结果表明该方法可以简便快速地分离纯化EGFP,纯度超过98%,同时保持了EGFP的荧光活性。

重组人Cu,Zn-SOD包含体的复性、纯化及复性蛋白稳定性研究

目的通过体外复性和纯化技术获得具有高纯度、高生物活性的重组人铜锌超氧化物歧化酶（rhCu,Zn-SOD）,并研究复性蛋白的稳定性。方法以透析法对在大肠杆菌中以包含体形式表达的rhCu,Zn-SOD进行复性,采用金属螯合亲和层析对复性样品进行纯化,通过酶活性测定考查复性和纯化的rhCu,Zn-SOD的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。结果建立了体外透析复性的基本条件,其比活可达2 380 U·mg^-1。该复性样品经金属螯合亲和层析纯化后,结果得到纯度大于95%、比活5 000 U·mg^-1、活性回收率大于100%的目的蛋白。复性和纯化蛋白在温度25-70℃和pH 5.0-10.5内活性稳定,并可耐受2-10 mol·L^-1的尿素和2%-8%的十二烷基硫酸钠（SDS）,对更强烈的变性剂盐酸胍稳定性较弱。结论确定了重组人Cu,Zn-SOD包含体的体外复性条件和复性蛋白纯化方法,且复性蛋白表现出很好的稳定性,为重组人Cu,Zn-SOD的生产奠定了良好基础。