重组人Fab金属螯合层析法纯化条件的研究

在重组人Fab (rhFab)表达载体的羧基端插入六个组氨酸 ,使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附 ,可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化 .采用自制金属 (铜、锌金属离子 )螯合层析介质 ,以 pH和咪唑两种洗脱方法 ,对rhFab段的纯化效果进行了探讨 .结果显示 :铜离子螯合层析介质比锌离子螯合层析介质对rhFab的亲和能力更强 ;pH洗脱方法的重复性优于咪唑法 ;金属铜离子螯合层析法对rhFab进行一步纯化可得到纯度大于

金属螯合层析介质的研制及其在纯化重组人铜锌超氧化物歧化酶中的应用

以琼脂糖Sepharose 4B为基质,经氯代环氧丙烷活化,与亚氨基二乙酸通过化学交联再与铜螯合,合成了金属铜螯合层析介质,结果显示此介质不仅具有特异性吸附能力,且有一定的刚性,对强碱和热亦有一定的耐受性.用此介质纯化人超氧化物歧化酶(rhSOD),即可得到高纯度的rhSOD产品,简化了纯化工艺,降低了生产成本.

金属螯合层析法纯化紫草籽中铜锌超氧化物歧化酶(英文)

本文报道了用金属螯合层析从紫草籽中分离Cu/Zn超氧化物歧化酶的一种新方法。在金属螯合层析过程中 ,运用了pH梯度和组氨酸梯度两种洗脱技术 ,取得良好效果。Cu/Zn超氧化物歧化酶最终比活为 5 36 8.75U/mg ,纯化倍数 36 6 .75 ,得率 18.7% ,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳法证明了其均一性。

金属螯合亲和层析法对人源宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的纯化

在重组人宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型抗体重链可变区蛋白的表达质粒（ｐＱＥＨｖ）的氨基端插入６个组氨酸，使其对金属螯合层析介质能产生特异性吸附，可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化。本研究采用ＮｉＮＴＡ螯合层析介质，以咪唑洗脱表达的蛋白。经ＥＬＩＳＡ检测，纯化的蛋白可特异地与抗宋内痢疾杆菌脂多糖的鼠ｍＡｂ５Ｂ１２发生反应。

金属螯合亲和层析分离蛋白质的研究

金属螯合亲和层析是近 2 0年发展起来的一项新型分离技术。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点 ,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。本文从单组分蛋白质入手 ,考查了 pH值、铵离子浓度、不同铵盐等对蛋白质洗脱的影响 ,并进行了分析。还对不同的金属螯合柱和不同性质蛋白质的洗脱性能进行了研究 ,比较了不同金属离子与蛋白质亲和力的区别 ,为实际体系的分离研究打下了基础。

金属螯合亲和层析介质用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究

以Sepharose CL-6B为载体,环氧氯丙烷为活化剂,羧甲基天冬氨酸(CM-Asp)为螯合配基制备载有Co2+的金属螯合亲和层析介质Co-CM-Asp-Sepharose,并将其用于六聚组氨酸融合蛋白的纯化研究。对纯化200μL细胞裂解液中靶蛋白所需Co-CM-Asp-Sepharose介质用量,Co-CM-Asp-Sepharose与细胞裂解液的孵育时间,介质清洗条件及靶蛋白洗脱时所需咪唑浓度等进行了优化。比较了Co-CM-Asp-Sepharose与Ni-NTA-Agarose(Qiagen公司)两种螯合介质对融合蛋白的纯化效果,开展了从5mL细胞裂解液中放大规模纯化融合蛋白的研究,并通过Bradford法测定了Co-CM-Asp-Sepharose对CD155D1蛋白的纯化量。结果表明:对200μL细胞裂解液纯化体系,Co-CM-Asp-Sepharose(50%悬浮液)的优选体积为60μL,最佳孵育时间为30min,洗脱液最佳咪唑浓度为200mmol/L,纯化得到融合蛋白的量约为200μg。介质用量放大为1.5mL(50%悬浮液)对CD155D1蛋白的纯化量可达4.6mg。与商品化Ni-NTA-Agarose相比,本介质具有选择性好,清洗条件简单,得到的靶蛋白纯度高等优点。

金属螯合亲和层析法纯化玉米SOD及其酶学性质的研究

利用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤初步分离了玉米SOD,利用金属螯合亲和层析纯化了SOD.电泳后活性染色与蛋白染色均得到3个条带,比活为8597,纯化倍数为307,回收率为29.4%,达到了电泳纯.结果表明玉米SOD亚基的分子量为16 000,最大紫外吸收在260 nm处,该酶在pH值7～9、80℃以下稳定,玉米SOD对KCN和H2O2敏感,对邻苯三酚的Vmax为49.50 mmol/min、Km为0.163 4 mmol/L.

重组Hepcidin融合蛋白的金属螯合亲和层析纯化

在大肠杆菌中表达的重组Hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在,其N端带有6个组氨酸。以Ni2+-IDA-Sepharose Fast Flow为层析介质,在变性条件下以不同的咪唑和pH值洗脱方式对Hepcidin融合蛋白的纯化效果进行了比较,确定了该融合蛋白的金属螯合层析纯化条件。以60 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白,然后将pH值降至4.0洗脱融合蛋白,纯化后的融合蛋白纯度大于95%,而且不含咪唑,有利于下一步Hepcidin的制备。金属螯合层析中融合蛋白收率不低于90%。Ni2+-IDA-Sepharose Fast Flow对该融合蛋白的吸附量为30.4 mg/mL。

以壳聚糖为载体金属螯合亲和层析法纯化猪红细胞Cu·Zn-SOD

从虾壳制备所得壳聚糖为基质合成金属螯合亲和吸附剂 ,用于纯化猪血铜锌超氧化物歧化酶 (Cu·Zn -SOD) ,得到比活为 4 75 6U·mg- 1的酶蛋白 ,收率为 67% ,纯化倍数为 6 1。聚丙烯酰胺凝胶电泳及活性染色定位表明 。

金属螯合亲和层析纯化和复性重组人铜锌超氧化物歧化酶

将重组人铜锌超氧化物歧化酶(rhCu,ZnSOD)包含体(经纯化后纯度达80%以上)以稀释法或透析法初步复性后,分别再经金属螯合亲和层析(MCAC)纯化。结果透析复性样品和稀释复性样品经MCAC纯化后的rhSOD比活是各自上柱前样品比活的2.2倍和5.3倍,蛋白回收率分别为64%和25%,同时两者活性回收率皆大于130%。表明目标蛋白rhSOD在经过MCAC纯化的同时又获得进一步复性。SDSPAGE显示rhSOD为19kD的单一条带,纯度大于95%,比活达到5000umg左右,同时NBT生物活性染色鉴定显示出很强的超氧化物歧化酶活性。表明MCAC对于复性不完全的rhCu,ZnSOD而言是一种纯化和使其进一步复性的简便省时且有效的方法。该方法为以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化和复性提供了新思路。

金属螯合亲和层析分离纯化重组人锰超氧化物歧化酶

以金属铜螯合的亲和层析方法分离纯化重组人锰超氧化物歧化酶,采用3种不同的洗脱方法都可以对重组酶进行分离纯化.但是通过鉴别比较,采用方法1即逐步降低洗脱液的pH和固定洗脱液的NH+4的浓度可以获得较好的结果,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得到一条分子质量约为22000u的蛋白条带,证明所得到的为纯度较高的重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD）。

金属螯合亲和层析介质及应用研究的进展

金属螯合亲和层析具有螯合介质制备简单,吸附容量大,选择性及通用性较好,易于再生,成本低等优点,是分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。本文综述了金属螯合亲和层析介质及最新应用方面的进展。

金属螯合亲和层析法对重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的纯化

背景:幽门螺杆菌（H.pylori）疫苗是近年研究的热点。H.pylori尿素酶B亚单位（UreB）是理想的候选抗原。目的:获得纯化的重组H.pylori UreB（rUreB）,为进一步的H.pylori疫苗制备打下基础。方法:采用金属螯合亲和层析法（MCAC）在变性条件下纯化rUreB,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和免疫印迹法鉴定纯化产物的分子量、纯度和抗原性。结果:纯化产物的分子量与预计分子量相符,具有良好的特异性UreB免疫原性,且一步即可达到90％以上的纯度。结论:MCAC是一种简单、高效的rUreB纯化方法。

固定化金属螯合亲和层析介质及其应用研究进展

固定化金属螯合亲和层析介质,因其具有固定化配基选择简单且稳定性高、复杂环境中一步纯化蛋白、特异性吸附、目标蛋白质吸附量大、蛋白洗脱条件温和、介质易再生、重复利用率高、制备工艺简单、造价低等多项优点,逐渐成为蛋白质分离纯化及多个相关领域中最有效的分离技术。通过综述固定化金属螯合亲和层析介质的工作原理、构成及应用现状,对固定化金属螯合亲和层析介质应用的前景进行展望。

金属螯合亲和层析技术及其应用

固定化金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术,它具有配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用强等特点。因此,其在蛋白质纯化、复性和空间定位以及酶的固定化和金属离子清除等方面具有广泛的应用。

以硅胶和Agarose 6B为载体金属螯合亲和层析分离纯化重组人Cu,Zn-SOD

以层析硅胶Agarose 6B ,制备了Cu2 + 螯合亲和载体 ,利用合成的Cu2 + IDA 硅胶亲和柱和Cu2 + IDA Agarose 6B亲和柱分离纯化了重组人Cu ,Zn SOD ,并比较了这两 2亲和载体的纯化效果和性能。硅胶纯化SOD的比活、纯化倍数和回收率分别为 75 86U/mg·protein、6 .5倍和 86 .7% ;而Agarose 6B纯化SOD的比活、纯化倍数和回收率则分别为 6 2 2 3/mg·protein、5 .8倍和 93.0 %。 2种亲和载体 5次使用后 。

壳聚糖-硅基凝胶微球作为固定化金属螯合亲和色谱基质的研究

采用溶胶凝胶及微乳液技术制备了以壳聚糖-硅基杂化材料为骨架并带有金属离子螯合官能团的球形基质(CSHB),并对该基质的制备条件及结构形貌进行了研究与表征。实验表明,当微乳液反应体系的组分为:100mL壳聚糖溶液(2%m/V)、100mL Span乳化剂、250mL环己烷、13.3mL四乙氧基硅烷(TEOS)、1.33mL 3-缩水甘油丙氧基三甲氧基硅烷(GPTMS)和亚氨基二乙酸(IDA)0.802g时,可获得粒径均匀,刚性较好的微球。红外光谱证明了该基质是一种多组分的杂合材料,差热分析数据表明该杂合材料的热稳定性随反应体系中GPTMS的含量增加而增大。CSHB通过动态吸附金属离子Cu2+与Ni2+后,可对金属螯合蛋白产生配位吸附作用。Cu2+-CSHB柱对牛血清蛋白(BSA)具良好的可逆吸附能力,蛋白能被咪唑等金属离子螯合剂洗脱,回收率达76.6%。BSA在CSHB柱上的吸附率只有4.7%,表明CSHB对蛋白的非特异吸附较低。Ni2+-CSHB柱对过氧化氢酶(CAT)也显示出初步的纯化效果,一步纯化倍数为2.43倍。该基质有望用于具有组氨酸纯化标签的基因工程表达蛋白的分离与纯化。

纤维素金属螯合物及其质谱分析在研究血清蛋白质与多肽中的应用

用纤维素做固相支持物,通过碱处理、环氧活化、偶联螯合剂、固定金属离子等方法制成纤维素金属螯合物,并用合成的纤维素金属螯合物处理健康人血清,然后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)检测蛋白质和多肽以确定其分离效果。确定了最佳的合成方法、螯合剂、金属离子和缓冲体系。再利用普通的纤维素制成了性能优良的纤维素金属螯合物,它能较好地分离血清中的蛋白质和多肽。

魔竽葡苷聚糖凝胶为亲和层析载体与Sepharose 4B的比较研究——Ⅰ.KGM金属螯和层析分离纯化猪血SOD

将KGM凝胶和Sepharose 4B在同样条件下活化偶联,制成Cu^(2+)金属螫合亲和胶,亲和纯化猪血SOD,并对这两种亲和胶的层析效果和性能进行了比较。KGM金属螫合胶对猪血SOD吸附量、纯化倍数、纯化SOD的比活力和回收率分别为53000U/ml胶、19倍、12000U/mg蛋白和94.6％,而Sepharose 4B亲和胶对SOD 的吸附量、纯化倍数、纯化SOD的比活力和回收率分别为79920U/ml胶、11倍、10125U/mg蛋白和95.4％。两种亲和胶所纯化的SOD经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、活性染色及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明其均为电泳纯。KGM金属螯合胶使用六次后,其对SOD吸附量、去Cu量及SOD的回收率均无明显影响。