缺氧通过磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-金属调节转录因子1信号通路诱导肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及迁移

目的 探索磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-金属调节转录因子1(MTF-1)信号通路对缺氧诱导的肺动脉高压(PH)大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和迁移的影响。方法 动物实验:将16只雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠随机均等分为对照组(Ctrl组)和缺氧诱导的PH组(hypoxia-PH组)。将hypoxia-PH组大鼠置于自制缺氧饲养玻璃箱内[氧浓度(10.0±0.2)%],连续缺氧3周后常氧2周建立慢性PH模型,Ctrl组大鼠在无特定病原体(SPF)级房间正常饲养。在造模5周后,右心导管法测定平均肺动脉压(mPAP),HE染色评估肺动脉形态学改变,组织免疫荧光观察MTF-1及胎盘生长因子(PlGF)的表达。Western-blot法检测组织中磷酸化Akt(p-Akt)、总Akt(T-Akt)、MTF-1及PlGF的表达。细胞实验:提取5只正常大鼠来源的PASMC,每只大鼠来源的PASMC分为对照-PASMC(Ctrl)、缺氧-PASMC(hypoxia)和缺氧+PI3K-Akt通路抑制剂LY294002-PASMC(hypoxia+LY294002)组。hypoxia组利用100μmol/L氯化钴干预24 h模拟缺氧条件,hypoxia+LY294002组在氯化钴干预前30 min加入LY294002,Ctrl组未行任何处理。Western-blot法检测细胞中p-Akt、T-Akt、MTF-1及PlGF的表达。通过5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)、流式细胞术和划痕实验评估PASMC增殖及迁移情况。结果 在动物实验中,hypoxia-PH组大鼠出现mPAP升高,肺血管壁增厚,右心室肥厚(均P<0.05)。组织免疫荧光染色及Western-blot可观察到hypoxia-PH组大鼠肺组织中p-Akt、MTF-1及PlGF表达较Ctrl组升高(均P<0.05),而T-Akt差异无统计学意义(P>0.05)。在细胞实验中,Western blot可观察到hypoxia组中p-Akt、MTF-1及PlGF表达较Ctrl组升高(均P<0.05),而LY294002可逆转这一结果。同时,EdU、流式细胞术及划痕实验显示hypoxia组的增殖迁移水平较Ctrl组增高,而LY294002可抑制这一过程[EdU实验阳性细胞比例:Ctrl (0.33±0.06)%比hypoxia (0.86±0.06)%比hypoxia+LY294002(0.41±0.14)%,F=24.13,P<0.01;流式细胞术G2+M细胞比例:Ctrl(4.49±0.39)%比hypoxia(16.86±1.74)%比hypoxia+LY294002(4.99±0.48)%,F=195.70,P<0.01;划痕实验细胞迁移率,24 h:Ctrl (21.80±3.88)%比hypoxia (41.53±1.96)%比hypoxia+LY294002 (25.94±6.63)%,F=15.47,P<0.01;48 h:Ctrl (39.92±1.06)%比hypoxia (73.01±3.96)%比hypoxia+LY294002 (42.97±4.80)%,F=75.61,P<0.01]。结论 缺氧可激活PI3K-Akt信号通路,进而促进MTF-1及PlGF表达,最终促进PASMC增殖及迁移。

金属调节转录因子-1调控破骨细胞分化及功能的研究

目的探讨金属调节转录因子-1(MTF-1)对破骨细胞分化和功能的影响并探讨其可能的分子机制。方法采用定量聚合酶链反应(qPCR)检测破骨细胞分化过程中MTF-1的表达变化。应用MTF-1小分子抑制剂LOR-253(50、100 nmol/L)抑制MTF-1转录活性后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、TRAP酶活检测、qPCR实验及骨板吸收试验,检测MTF-1功能抑制对破骨细胞分化与功能的影响。采用单因素方差分析ANOVA和SNK检验分析组间差异。结果核因子κB受体活化因子配体(RANKL)处理后1d,RAW264.7细胞的MTF-1表达水平升高达5.13倍。LOR-253下调MTF-1转录活性后,RANKL诱导形成的破骨细胞数目显著减少(F=686.079,P<0.05),对照组为(74.6±3.2)个,50 nmol/L组为(35.2±1.7)个,100 nmol/L组为(9.2±0.7)个;TRAP酶活性也显著降低(F=2119.937,P<0.05);骨板吸收面积明显减少(F=463.123,P<0.05),对照组为(75.0±6.3)%,50 nmol/L组为(49.7±3.4)%,100 nmol/L组为(15.9±1.4)%;破骨细胞标志基因(抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9)及分化调控基因活化T细胞核因子-1(NFATC1)的表达均明显下调,50 nmol/L组分别为0.70±0.02、0.65±0.02、0.34±0.01、0.80±0.01,100 nmol/L组分别为0.60±0.01、0.40±0.02、0.30±0.01、0.75±0.01(F=780.000、1735.929、6954.000、787.500,P<0.05)。结论采用LOR-253抑制MTF-1转录活性明显抑制了破骨细胞的分化与功能,而NFATC1在其中发挥了重要作用。