中华稻蝗金属应答转录因子基因OcMTF-1的分子特性及表达分析

【目的】金属应答转录因子-1(metal-responsive transcription factor-1,MTF-1)是一种多功能转录调控蛋白,可在机体应对重金属、低氧或氧化压力环境时发挥作用。本研究旨在确定中华稻蝗Oxya chinensis MTF-1基因在不同组织部位及不同发育时期的表达模式。【方法】基于中华稻蝗转录组数据库,搜索到MTF-1 cDNA片段,采用RACE方法克隆获得MTF-1的5'端和3'端序列。利用不同生物信息学软件对所得序列进行结构域预测、氨基酸序列比对和进化树分析。根据该基因的核苷酸序列,设计特异性表达引物,利用RT-qPCR方法研究其在中华稻蝗不同组织部位及不同发育时期的表达。【结果】克隆获得中华稻蝗MTF-1 cDNA全长序列,命名为OcMTF-1(GenBank登录号:KM017748),其长为1 834 bp,其中开放式阅读框(ORF)为1 527 bp,编码508个氨基酸。结构域预测发现,该序列只含有6个C2H2型锌指结构,无其他激活域。氨基酸序列比对发现,OcMTF-1 N端的锌指结构域与目前已知的其他昆虫的MTF-1有很高的相似度。OcMTF-1在中华稻蝗马氏管中高表达,其次是后肠和脂肪体,其他组织部位表达量相对较低;在1-5龄若虫期和成虫期均表达。【结论】本研究克隆获得中华稻蝗OcMTF-1基因cDNA全长序列,其编码蛋白N端的锌指结构域与其他昆虫MTF-1序列一致性较高。该基因在中华稻蝗马氏管中高表达;在若虫和成虫各发育阶段均有表达,其中1龄若虫期表达量最高。研究结果为进一步探索OcMTF-1基因的转录调控机制提供了基础资料。

金属调节转录因子-1调控破骨细胞分化及功能的研究

目的探讨金属调节转录因子-1(MTF-1)对破骨细胞分化和功能的影响并探讨其可能的分子机制。方法采用定量聚合酶链反应(qPCR)检测破骨细胞分化过程中MTF-1的表达变化。应用MTF-1小分子抑制剂LOR-253(50、100 nmol/L)抑制MTF-1转录活性后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、TRAP酶活检测、qPCR实验及骨板吸收试验,检测MTF-1功能抑制对破骨细胞分化与功能的影响。采用单因素方差分析ANOVA和SNK检验分析组间差异。结果核因子κB受体活化因子配体(RANKL)处理后1d,RAW264.7细胞的MTF-1表达水平升高达5.13倍。LOR-253下调MTF-1转录活性后,RANKL诱导形成的破骨细胞数目显著减少(F=686.079,P<0.05),对照组为(74.6±3.2)个,50 nmol/L组为(35.2±1.7)个,100 nmol/L组为(9.2±0.7)个;TRAP酶活性也显著降低(F=2119.937,P<0.05);骨板吸收面积明显减少(F=463.123,P<0.05),对照组为(75.0±6.3)%,50 nmol/L组为(49.7±3.4)%,100 nmol/L组为(15.9±1.4)%;破骨细胞标志基因(抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9)及分化调控基因活化T细胞核因子-1(NFATC1)的表达均明显下调,50 nmol/L组分别为0.70±0.02、0.65±0.02、0.34±0.01、0.80±0.01,100 nmol/L组分别为0.60±0.01、0.40±0.02、0.30±0.01、0.75±0.01(F=780.000、1735.929、6954.000、787.500,P<0.05)。结论采用LOR-253抑制MTF-1转录活性明显抑制了破骨细胞的分化与功能,而NFATC1在其中发挥了重要作用。

miR-16通过调控NF-κB1／MMP-9信号通路抑制胶质瘤侵袭的实验研究

目的探讨miR-16、核转录因子-κBI（NF—κB1）在人脑胶质瘤中的表达及其与胶质瘤细胞株SHG44、U87和U373侵袭生长的相关性。方法（1）收集苏州大学第一附属医院神经外科自2000年1月至2011年1月手术切除的29例胶质瘤组织和同期行减压术切除的6例正常脑组织标本，qRT-PCR检测标本miR-16、NF—κB1的表达。（2）将体外培养的U87、U373和SHG44细胞分为空白组、无义序列转染组，miR。16模拟物转染组，分别转染miR-16无义序列和miR-16模拟物，48h后qRT-PCR检测细胞miR-16、NF—κB1的表达；Transwell实验检测细胞侵袭能力；72h后Western blotting检测细胞NF—κB1、基质金属蛋白酶（MMP）-9和MMP-2蛋白的表达。（3）荧光素酶实验检测miR-16对NF-κB1基因的靶向调控作用。（4）以U87细胞作为阴性对照组，构建稳定表达miR-16的U87细胞株并建立颅内肿瘤、皮下肿瘤裸鼠模型（U87-miR-16组），免疫荧光、免疫组化分别检测2组裸鼠颅内肿瘤MMP9和Ki-67、NF-κB1、MMP9蛋白的表达；测量2组裸鼠皮下肿瘤的体积并绘制其生长曲线。结果（1）qRT—PCR显示miR-16在人脑胶质瘤中表达低于正常脑组织，且miR-16在Ⅰ级、Ⅱ和Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤中的表达量逐渐降低；NF-κB1胶质瘤中的表达高于正常脑组织，且NF—κB1在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中的表达量逐渐增高，差异有统计学意义（P〈0.05）。（2）与空白组和无义序列转染组比较，miR-16模拟物转染组细胞miR-16表达增加，Ⅳ-KBl基因表达下降，侵袭能力下降，NF—κB1和MMP-9蛋白的表达下降，差异均有统计学意义（P〈0.05）。（3）荧光素酶实验显示pMIR-NF-κB1的荧光标准化比值明显高于pMIR-NF—κB1＋pre-miR-16组，差异有统计学意义（P〈0.05）。（4）与U87阴性对照组比较，U87-miR-16组模型后第24-42天裸鼠皮下肿瘤的体积较小，差异有统计学意义（P〈0.05）。与U87阴性对照组比较，U87-miR-16组裸鼠颅内肿瘤MMP-9的表达较低，NF-κB1、MMP-9和Ki-67的表达较低（Ki=67增殖指数分别为13.91％、32.98％）。结论miR-16通过调控NF-κB1MMP-9的表达从而抑制胶质瘤细胞侵袭和生长。

细胞内锌离子动态平衡及其与疾病的关系

锌离子是人体的必需微量元素,广泛参与细胞的增殖和分化、核酸与蛋白质的合成以及其它许多重要的生理活动。人体内锌离子缺乏会导致免疫力下降、男性生殖功能减退等问题;然而锌离子过剩,也会引发缺铁性贫血、提高心血管疾病发病率等。因此,维持体内锌离子的动态平衡、对于人体健康有着极其重要的作用。文章就细胞内调控锌离子动态平衡的4大关键成分:金属硫蛋白(MT,Metallothionein)、ZIP/SLC39A家族蛋白(solute-linked carrier 39A,SLC39A)、ZnT/SLC30A家族蛋白(solute-linked carrier 30A,SLC30A)、金属转录因子-1(Metal-response element-binding transcription factor-1)的结构功能及与锌离子动态平衡的关系,以及因锌离子动态平衡失衡而引发的多种疾病进行了总结和归纳。