金柑杂交授粉生物学特性研究

【目的】掌握金柑花粉活力与柱头可授性的变化情况,寻找最佳授粉时期,探明金柑杂交授粉的生物学特性,提高杂交成功率。【方法】对23份金柑材料进行胚型的统计。选择不同胚数材料,采用TTC染色法和联苯胺-过氧化氢法分别对小蕾期、大蕾期、初开期和盛开期的花粉活力和柱头可授性进行研究。对金柑进行去雄不授粉、自交授粉和杂交授粉处理,比较自交和杂交花粉管的生长情况及3种处理下的坐果率。【结果】罗纹种胚数最少,适合作母本,其次是山金柑、金弹和罗浮,而长寿金柑的胚数最多;花粉活力和柱头可授性均在4个时期呈先增后减的趋势,并均在初开期达到了最高活性;金柑杂交花粉管和部分的自交花粉管均进入了子房;除宁波金弹和宁波罗纹CS外,其他5种金柑种质杂交授粉比自交授粉的坐果率更高,并呈极显著性差异;母本的柱头活性越高,坐果率越高,种内杂交坐果率高于种间,并呈极显著性差异;金柑去雄不授粉下仍能得到果实,具有单性结实的特性。【结论】金柑杂交中应选择单胚型母本材料;金柑属于雌雄同熟,采集花粉最佳时期和授粉最佳时期均为初开期;金柑杂交亲和性比自交亲和性更强,有利于金柑的杂交育种。

金柑组织培养与快速繁殖体系的建立

为了建立金柑组织培养与快速繁殖体系,以金柑胚根、子叶、茎段、叶片等不同外植体为材料,采用器官发生型以及短枝扦插型为主要培养途径,进行金柑组织培养,研究不同浓度植物生长调节剂对金柑快速繁殖体系建立的影响以及愈伤组织诱导和分化的最适条件,筛选出诱导愈伤组织形成不定芽的最佳外植体与最适培养基。结果表明,金柑诱导愈伤组织形成不定芽的最佳外植体为幼嫩的茎段,诱导金柑子叶形成愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂,诱导子叶愈伤组织分化不定芽的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂。

福建省金柑黄化衰退病的病原种类鉴定

金柑Citrus japonica是福建省尤溪县的重要特色果树,多年来金柑黄化衰退问题在其产区较为严重。本研究意在明确金柑黄化衰退的病因,为有效防控提供依据。调查发现金柑黄化衰退病株根部生长不良,根上有线虫雌虫寄生,其体后部突出根表面,根际土壤中有大量的2龄线虫;相邻健树根部生长健壮,根部无或只有少量该线虫。为明确其病原线虫种类,对其雌虫、雄虫、2龄幼虫进行形态学观测,对线虫的rDNA-ITS、28S rDNA D2-D3区进行测序比对,采用最大似然法和贝叶斯法构建系统进化树分析。结果表明,线虫形态学特征与柑橘半穿刺线虫Tylenchulus semipenetrans一致,系统发育树分析进一步明确为柑橘半穿刺线虫。这是国内首次报道柑橘半穿刺线虫寄生金柑,是导致金柑黄化慢衰的病因。研究结果为制订有效防控策略提供了重要理论依据。

基于CNKI数据库的金柑研究文献计量分析

为了解金柑在国内相关研究的进展,以文献计量的方法对金柑的学术研究进行探讨,通过Cite Space软件分析作者、机构、关键词等进行统计分析并作出评价。金柑领域发文量总体呈递增趋势。从作者共线图中可以发现,广西特色作物研究院金柑团队规模最大、发文量最多。从研究领域来看,金柑研究主要集中在品种选育、栽培技术、品质优化等方面。本文总结了过去20年金柑的研究热点,将为从事金柑领域的研究方向提供参考。

赣南野生山金柑种质资源收集与鉴定

通过与赣南各县(区)果业主管部门合作及走访果农,在赣南进行了野生山金柑种质资源调查与收集,共收集与鉴定评价野生山金柑种质资源716份。结果表明,赣南野生山金柑分布于安远、龙南、章贡、崇义、于都、信丰等县(区),可分为野生和人工移植两类,主要生存环境为原始森林、山林、山谷、丘陵和盆景;性状分析发现树姿、节间长度、刺数量、刺长度、叶片长度、叶片宽度、叶柄、叶形、翼叶、叶尖缺刻、单果重量、果面主色、果面杂色、种子数量、油胞明显度、果皮厚度16个性状存在差异;进一步基于差异性状进行聚类分析,在欧氏距离等于17.5时716份种质被分为4大类,欧氏距离小于14时可进一步分成8小类;基于16个性状进行主成分分析得到6个特征值大于1且与农艺性状相关联的主成分。根据柑橘产业需求,筛选出3份无刺、34份无籽、67份大果、12份晚熟的野生山金柑种质资源。综上,赣南野生山金柑鉴定结果对山金柑新品种选育、柑橘产业发展具有较明确的利用价值。

叶面喷施硒肥对滑皮金柑果实品质的影响

以滑皮金柑为研究对象,纳米硒、亚硒酸钠为硒源,分析叶面喷施硒肥对植株叶片叶绿素含量和果实产量、可溶性固形物、维生素C、还原糖、可溶性总糖、丙二醛含量,以及谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响。结果表明,与CK相比,叶面喷施纳米硒、亚硒酸钠后,滑皮金柑果肉、果皮、叶片硒含量分别提高230.6%和118.5%、253.8%和79.8%、616.3%和185.0%;果肉、果皮、叶片的GPx活性均显著高于CK处理;果肉、果皮、叶片的MDA含量均显著降低。叶面喷施纳米硒比亚硒酸钠对促进滑皮金柑果实生长、果实品质形成效果更佳。

金柑磷酸蔗糖磷酸酶的基因克隆、表达与蛋白结构分析

磷酸蔗糖磷酸酶(SPP)是植物蔗糖生物合成最后一步催化反应的关键酶,对调控植物生长发育不同时期的蔗糖合成过程有重要作用。为探索金柑(Fortunella crassifiolia Swingle)SPP基因及其编码蛋白的序列特征及其在果实发育过程的表达特性,本研究以四倍体品种脆蜜金柑(F.crassifiolia Swingle cv.Cuimi)为试验材料,采用反转录PCR和cDNA末端快速克隆(RACE)方法从金柑果肉中克隆SPP基因,对其进行生物信息学和原核表达分析,并检测果实发育不同时期该基因在果肉中的表达量。结果表明,FcSPP基因的cDNA序列全长1638 bp,最长开放阅读框(ORF)为1191 bp,编码396个氨基酸,理论等电点为6.57,为稳定的亲水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。FcSPP蛋白含有S6PP和S6PP_C保守结构域,属于植物磷酸蔗糖磷酸酶家族成员。系统进化分析结果显示,FcSPP蛋白与甜橙SPP同源性最高,在进化树上与拟南芥等双子叶植物SPP划归为一类。此外,本研究构建了FcSPP基因的原核表达载体,诱导表达获得纯化的FcSPP蛋白,分子量鉴定为45.96 kDa。定量分析结果表明,脆蜜金柑果实发育4个时期FcSPP基因相对表达量呈逐步上升趋势,果实膨大期、成熟期的果肉组织中该基因表达量显著高于初果期和生长期(P<0.05)。本研究为解析金柑果实蔗糖生物合成的分子机制及调控蔗糖生物合成相关基因的研究提供了理论基础。

利用InDel标记筛选多胚山金柑珠心苗后代

【目的】柑橘的遗传转化通常以实生苗上胚轴为外植体。作为基因组高度杂合的无融合生殖物种,柑橘多胚种子中常含有一定比例的、因遗传重组较亲本表现出遗传背景差异的有性后代,从实生群体中筛选无性后代进行遗传转化实验可有效保证外植体材料遗传背景的一致性及后续相关研究的科学性和可靠性。基于此,开发分子标记用于快速准确筛选柑橘短童期种质——多胚山金柑(Fortunella hindsii)子代中的珠心胚实生苗,以期为优化完善山金柑遗传转化体系提供基础。【方法】利用母本山金柑材料DB02重测序数据进行InDel标记的挖掘,筛选出可以区分有性后代和无性后代的InDel标记,通过琼脂糖凝胶电泳对DB02系山金柑的子代幼苗进行鉴定。【结果】开发出7对可以区分DB02系山金柑种子中有性和无性后代的InDel杂合位点标记(InDel1~InDel7),基于这些标记进一步研究,发现土播幼苗和试管幼苗中的珠心苗比例分别为87.5%和74.2%。【结论】利用InDel标记可以成功筛选出与DB02系山金柑遗传背景一致的无性克隆后代,进一步完善了山金柑实生苗上胚轴遗传转化体系。

21份金柑种质的果实品质分析与综合评价

金柑是唯一皮肉同食的柑橘类水果,为探明不同金柑种质外观品质和内在品质的差异,以湖南农业大学金柑种质资源圃的21份金柑种质为研究对象,测定包含果实色泽在内的9个外观品质指标和8个内在品质指标,利用主成分分析法(PCA)对果实品质进行综合评价。结果表明:公孙橘的单果重(73.13 g)、纵横径(39.25、57.47 mm)均高于其他种质,适合加工;金橘和宁波金弹CQ的果实色泽均优于其他种质,适合观赏;融安脆蜜的可食率(98.40%)、固酸比(363.83)、糖酸比(140.50)和种子数(1.33)等内在品质均优于其他种质,可滴定酸含量(0.06%)低于其他种质,适合鲜食。通过主成分分析提取出3个主成分,累计贡献率达81.211%,再利用综合评价函数分析获得21份金柑种质的综合评价结果,最终得分排名前5位为金橘>公孙橘>野生金柑>融安金柑>寿星橘,金橘和公孙橘综合品质较高。

不同生长阶段金柑果实中类黄酮等活性物质含量差异分析

为探究金柑果实发育过程中类黄酮含量、酚酸含量、类柠檬苦素、生物碱及香豆素含量的动态变化规律及含量差异,以不同生长期8个金柑品种全果为研究对象,采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法分析其5类生物活性成分含量变化及差异。结果表明,9~12月份期间,在8个品种金柑果实中共检测到85种生物活性成分,包括48种类黄酮(黄酮、多甲氧基黄酮为主),9种酚酸(绿原酸、芥子酸)、3种类柠檬苦素(柠檬苦素为主),5种生物碱(N-甲基酪胺、酪胺为主)和20种香豆素(滨蒿内酯为主);随着果实的膨大,花后35~125 d金柑果实中类黄酮、类柠檬苦素、生物碱总含量随着成熟度的增加而急剧减少,花后95 d左右趋于平缓;发育过程中金柑果实的酚酸、香豆素总含量变化差异显著;8个金柑品种中,金柑杂种的总类黄酮含量最高,但其金柑特有类黄酮金柑苷含量极少,其他7种金柑中总类黄酮含量均以金柑苷为主,含量占类黄酮总量的26.08%~79.08%。该研究建立了金柑苷检测方法,研究结果明确了金柑果实不同生长时期的生物活性成分差异,为金柑果实资源的综合利用以及保健品开发提供了数据支撑。

乙烯利与肥料复配处理对金弹类金柑果实着色进程和品质的影响

在广西阳朔县白沙镇蕉芭林村,以“阳朔1号”金柑果实为研究对象,按三因素三水平L_(9)(3~4)的正交试验方案设置乙烯利、磷酸二氢钾和含氨基酸水溶肥复配的9个处理,以清水为空白对照,于果实转色初期(11月中旬)开始间隔10 d树冠喷施两次,研究复配处理对金柑果实着色和品质的影响。结果表明,各复配处理均能使金柑果实着色进程加快;第1次喷施30 d后,与对照相比,部分复配处理的着色指数显著提高,所有复配处理果皮叶绿素含量显著降低,部分复配处理果皮类胡萝卜素含量显著升高,部分复配处理的果实可溶性糖含量、可溶性固形物和维生素C含量及固酸比显著增大,所有复配处理的单果质量和果实可滴定酸含量无显著变化,部分复配处理增加了叶片叶绿素含量。综合评价,80 mg/L乙烯利+0.3%磷酸二氢钾+含氨基酸水溶肥800倍液改善金柑果实着色和提高果实品质的综合效果最佳。

金柑种质资源的胚型分析

为了选出优良的单胚母本,为杂交育种作准备。统计了2021年和2022年29份金柑种质的胚型及单胚率,并用SPSS软件进行双因素方差分析和聚类分析。结果表明:福建大果罗浮和罗纹单胚率极高,为89.2%~100.0%,且罗纹两年间无明显差异,属于单胚型;其中浏阳金柑和花叶金柑单胚率为52.8%~87.3%,也表现为较高单胚率,可作备选杂交母本;其余种质单胚率低,属于多胚型,适于通过胚胎挽救来获得杂交种。29份金柑种质分为单胚型、单胚率居中型、多胚型3个类型,金柑单胚率聚类分析基本印证了这一结论。

植物生长调节剂处理对金弹类金柑幼果生长发育的影响

为确定最适用于金弹类金柑(金桔)幼果生长发育的植物生长调节剂种类及浓度,在金柑第二批花期后幼果膨大期,分别用4种浓度梯度的赤霉素(GA_(3))、6-苄氨基嘌呤(6-BA)和芸苔素(BR)配合相同叶面肥进行树冠喷施2次(间隔约半月)处理,以只喷叶面肥为对照,对不同处理幼果的横径、纵径、果柄长度、果形指数、可溶性糖、还原糖、可溶性蛋白、过氧化物酶等8个生长发育指标进行比较。结果表明,一定浓度GA_(3)、6-BA和BR处理,可以促进幼果生长,对幼果横纵径和内含物质有显著促进作用,对果柄长度的影响不显著。综合评价不同处理金柑幼果生长发育表现,所有外源植物生长调节剂处理均优于CK,其中,6-BA 60 mg/L处理的效果最佳,最能促进金柑幼果生长发育。

软枝香橙等砧木对金柑生长结果与果实品质的影响

在广西桂林红壤土上,以土柠檬(Citrus limonia,?檬)、枳(Poncirus trifoliata)、三湖红桔(C.tangerina)、红皮酸桔(C.reticulata)、软枝香橙(C.junos)、卡里佐枳橙(C.sinensis×P.trifoliata)、金柑(Fortunella crassifolia,本砧)砧金柑嫁接树及金柑实生树为研究对象,比较砧穗组合亲和性、植株生长量、产量和果实品质差异,综合评价各砧穗组合的表现。结果表明,定植后第6年,红皮酸桔砧和软枝香橙砧金柑的植株干周分别为23.7和22.5 cm,大于其他砧金柑和实生金柑;三湖红桔砧和红皮酸桔砧金柑的植株高度分别为247和239 cm,高于其他砧金柑和实生金柑;红皮酸桔砧、枳砧、三湖红桔砧和软枝香橙砧金柑的植株冠幅达200 cm以上,大于其他2个砧金柑和实生金柑。3年生试挂果期,三湖红桔砧金柑的产量较高,其次是软枝香橙砧金柑,其他中等或低;4~6年生正式挂果期3年平均株产量,软枝香橙砧和红皮酸桔砧金柑达16.10 kg以上,枳砧和三湖红桔砧金柑达13.40 kg,均高于其他2个砧金柑和实生金柑。枳砧金柑的果实品质较好,土柠檬砧金柑较差,其他中等。综合性状表现良好的是软枝香橙砧和红皮酸桔砧金柑,其次是三湖红桔砧和枳砧金柑,表现较差是土柠檬砧、本砧金柑和实生金柑。在广西红壤土上,金柑最适宜的砧木是软枝香橙和红皮酸桔,其次是三湖红桔、枳和本砧,卡里佐枳橙、土柠檬不宜作砧木,也不宜实生繁殖。

金柑属及其近缘属植物亲缘关系的SSR分析

用SSR标记分析了金柑属(Fortunella)及柑橘属(Citrus)植物的亲缘关系。选取的22对柑橘属SSR引物中,有14对能在所有材料中扩增出带纹,表明柑橘属SSR引物在金柑属植物上具有一定的通用性。在18个材料中扩增得到275个位点,平均每对引物扩增出19.7个位点。用NTSYS-PC软件进行分析,结果表明,金柑属植物与宽皮柑橘的亲缘关系很近;SSR聚类结果支持长寿金柑种的地位;支持宁波金弹、融安金弹、蓝山金柑均为金弹的栽培种的结论。为金柑属种质的保存、育种和分类提供了分子水平上的依据。

中越金柑种质资源的ISSR分析

为了更好地利用和创新金柑种质资源,用ISSR分子标记技术分析了25份来自中越金柑属种质资源与金弹变异系的亲缘关系及特异性。从100条引物中筛选出10条多态性好、扩增清晰的引物。结果显示,10条引物共扩增出120条带,其中102条具有多态性,多态性带比率为85%。用UPGMA软件进行聚类分析,25份金柑种质资源的遗传相似系数在0.48～0.99,在遗传系数为0.85水平处将25份供试资源划分为8类,对聚类结果进行分析。中越边境野生山桔资源可能为金柑属的新种类或变种。

遂川金柑营养成分的分析研究

对遂川金柑果实的营养成分，包括糖、酸、果胶、氨基酸、维生素、蛋白质和人体必需的矿质元素（Ｋ，Ｃａ，Ｎａ，Ｍｇ，Ｍｎ，Ｃｕ，Ｚｎ）进行了测定分析，结果表明遂川金柑果实中糖类、蛋白质、β－胡萝卜素、Ｋ、Ｃａ、Ｆｅ等营养物质含量丰富，且有较高的营养价值，值得进一步研究与开发。

金柑多糖酶法脱蛋白工艺的研究

蛋白酶法结合Sevag法对金柑粗多糖进行脱蛋白,研究不同酶添加量、温度、pH值、时间等因素对金柑粗多糖脱蛋白效果的影响。结果表明,金柑粗多糖酶法脱蛋白最佳工艺条件是:木瓜蛋白酶添加量120 U/mL、酶解时间80 min和酶解温度40℃;在此条件下,蛋白质脱除率为75.88%,多糖的损失率为5.45%;再用Sevag试剂处理3次,蛋白质脱除率和多糖损失率分别为85.18%和14.16%。

酶法辅助提取金柑皮总黄酮的工艺优化研究

采用纤维素酶辅助提取技术进行金柑皮总黄酮提取工艺研究。以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH可见光分光光度显色法测定总黄酮含量,选用单因素试验探索料液比、温度、乙醇浓度、酶量和提取时间对金柑黄酮提取率的影响,并在此基础上开展正交试验对工艺条件进行优化。结果表明,各因素对提取效果影响由大到小依次为:乙醇浓度>温度>料液比>酶用量>提取时间,最佳提取工艺条件为:乙醇浓度是70%,料液比1:35,酶用量75U/mL、温度50℃,提取时间100min,黄酮得率为1.39%,平均回收率103%。

响应面法优化金柑多糖碱提取工艺的研究

为研究碱溶液提取金柑多糖的最佳工艺,考察液料比、提取时间、提取温度、Na OH浓度和提取次数等5个因素对金柑多糖得率的影响。在单因素研究的基础上,采用五元二次旋转正交设计对其工艺进行优化,利用SAS 9.2响应面分析程序得到回归方程。结果表明:回归方程达到显著水平,多糖的最佳碱提取工艺条件为:液料比(V/W)41∶1,提取时间3.5 h,提取温度89℃,Na OH浓度0.05 mol/L,提取次数3次。在此条件下,多糖得率为(8.56±0.23)%,与理论预测值基本一致,相比传统热水浸提法,多糖得率提高3.73倍。