金黄色葡萄球菌A蛋白基因的克隆、表达和纯化

通过PCR方法从金黄色葡萄球菌CowanⅠ菌株中克隆获得的A蛋白基因,与表达载体pET21a连接,将带有目的基因的质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)中并进行IPTG诱导表达,表达产物进行Q-sepharose纯化,初步获得了金黄色葡萄球菌A蛋白。

金葡菌A蛋白酶联免疫吸附试验诊断脑囊虫病的研究

配合各对照组,应用金葡萄A蛋白-酶联免疫吸附试验检测脑囊虫病患者血清和脑脊液中抗囊虫抗体,结果表明血清抗体敏感性100.0％,特异性95.73％;脑脊液敏感性为78.57％,特异性100.00％,血清阳性率明显高于脑脊液(P<0.01);二者同时检测之阳性符合率为78.57％。血清和脑脊液抗体平均几何滴度分别为1:1110.90和1:21.30,二者的滴度差异有高度显著性<P<0.001).另外,还将血清检测结果与CT结果进行了比较。

致皮肤软组织感染社区获得性金黄色葡萄球菌的分子生物特征分析

目的：了解解放军总医院第一附属医院致皮肤软组织感染社区获得性金黄色葡萄球菌（ CA-SA）的流行情况、耐药特点、毒力和致病因素信息。方法收集2009年1月至2010年8月皮肤科、门诊、急诊55例患者化脓性皮肤软组织感染检测标本，进行细菌鉴定和药敏试验，采用多位点序列分型（ MLST）、金黄色葡萄球菌A蛋白（ SPA）分型和毒素基因检测筛查。结果55例中分离到社区获得性甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（CA-MSSA）12株；药敏结果显示CA-MSSA除对红霉素、克林霉素、四环素、庆大霉素和左氧氟沙星耐药性较高（8.3％～50.0％），对其他抗菌药物均敏感。毒素基因检测显示杀白细胞素（pvl）、肠毒素C（sec）和毒性休克综合征毒素－1（tsst-1）在CA-MSSA中的阳性率分别为33.3％，25.0％和8.3％，未检测到葡萄球菌肠毒素H（seh）和葡萄球菌表皮剥脱毒素（et）；结合MLST和SPA分型，发现CA-MSSA中的克隆有ST5-t002（2株）、ST22-t309（2株）及 ST398-t034、ST15-t5864、ST7-t091、ST25-t078、ST30-t318、ST121-t1425、ST800-t1425、ST630-t377各1株。结论我院致皮肤软组织感染CA-MSSA菌株对抗菌药物的敏感性较高，分子分型具有多样性，携带多种毒素。

猩红热监测病例分离金黄色葡萄球菌病原特征分析

目的了解猩红热样病例中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的感染情况,为非A组溶血性链球菌感染导致的咽峡炎提供病因线索。方法采集2019—2022年北京市某区猩红热监测病例的咽拭子样本373份并进行金黄色葡萄球菌分离,对分离菌株进行金黄色葡萄球菌A蛋白基因多态性(spa)分型和对12种抗生素的耐药表型检测,分析其分子特征和耐药特征。结果373份咽拭子样本中SA检出率为6.97%(26/373),男性和女性检出率分别为7.43%(15/202)和6.43%(11/171),检出率比较差异无统计学意义(χ^(2)=0.141,P=0.839);金黄色葡萄球菌的检出病例主要在20岁以下人群,<6岁、6~<11岁、11~<16岁、≥16岁4个年龄组金黄色葡萄球菌检出率分别为5.24%(13/248)、11.65%(12/103)、6.25%(1/16)和0(0/6)。分离到的26株金黄色葡萄球菌共分布10个spa型别,构成比前3位为t652(26.92%,7/26)、t309(15.38%,4/26)、t693(11.54%,3/26)和t571(11.54%,3/26)。26株金黄色葡萄球菌对PEN、TET、ERY、OXA、CFX耐药率分别为92.31%(24/26)、23.08%(6/26)、19.23%(5/26)、7.69%(2/26)和7.69%(2/26),分布9种耐药谱,优势耐药谱为PEN单独耐药(50.00%,13/26),其次为PEN+TET联合耐药(19.23%,5/26)和PEN+ERY联合耐药(7.69%,2/26)。多重耐药率为11.54%(3/26)。结论北京市某区猩红热监测病例中金黄色葡萄球菌检出率较高,分离株spa分型分布多样但在短期内呈现一定聚集分布特征,且不同年份具有不同的优势型别。金黄色葡萄球菌分离株对PEN处于高耐药水平而对OXA和CFX处于较低耐药水平。

动物布鲁氏菌抗体胶体金试纸膜检测试剂盒

本发明公开一种动物布鲁氏菌抗体胶体金试纸膜检测试剂盒，根据抗原抗体能特异结合的免疫学基本原理，利用胶体金免疫层析技术和银染加强技术，以重组的金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）作为金标抗体，以高纯度的布鲁氏菌LPS作为包被抗原，利用羊抗牛IgG为质控线制备胶体金试纸条。本发明能够准确区分动物布鲁氏菌病种型，可同时检测牛、羊、猪种动物布鲁氏菌病，且不发生交叉反应，假阳性率低，与常规分离培养的阴、阳性符合率为100％。检测快捷，5min内便可得出结果，不需要复杂的检测仪器为辅助，解决基层单位和普通兽医工作者对动物布鲁氏菌病的普查和病例检测难的问题，特别适合基层医务和兽医工作者使用。

一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析方法的建立

目的建立一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析检测方法。方法以荧光纳米颗粒作为示踪标记物,采用双抗体夹心法检测金黄色葡萄球菌A蛋白,制备了稀土离子标记的免疫层析试纸条,在紫外激发光源下判断反应结果。对该方法的特异性、敏感性和样本检测的适用性进行了分析。结果所制备的试纸条具有良好的特异性,与表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌、O1/O139群霍乱弧菌、副溶血性弧菌均无交叉反应。用该试纸条检测纯菌液和未经培养的粪便、呕吐物的灵敏度为7.2×104CFU/ml,检测经培养的模拟污染食物样本、粪便样本的检测限最低为7.2×102CFU/ml,反应在15 min内完成。结论本研究成功建立了金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析检测方法,能够快速检测食品、奶制品、呕吐物、粪便中的金黄色葡萄球菌,具有良好的特异性和灵敏性,便于开展现场快速检测。

SPA协同凝集试验快速诊断鸡马立克氏病的研究

应用鸡胚成纤维细胞(CEF)培养MDV-814株,经反复冻融、超声波处理、差速离心法纯化病毒,制成油乳剂灭活抗原;皮内多点注射法免疫健康家兔,获得高效价的免疫血清,经56℃、30min灭能,用硫酸铵沉降3次后,再用透析袋透洗,以除去部分NH4+和SO42-,最后用DEAE离子交换柱提取IgG。用IgG 2次标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)制成致敏的SPA菌悬液,用SPA协同凝集试验检测病鸡羽毛囊中MD特异性抗原。试验证明,上述方法的灵敏度是AGPT的48倍。整个试验只需几分钟即可完成,不需要复杂的仪器设备,具有操作简便,检测速度快,结果准确和便于现场应用等优点。

应用致敏SPA菌体提高CAV/CPV PCR检出率的研究

为消除粪便等病料中的PCR干扰物质 ,提高犬腺病毒与细小病毒 (CAV CPV)联合PCR检出率。根据免疫吸附的原理 ,应用CAV CPV高免血清致敏含A蛋白的金黄色葡萄球菌 ,制成致敏SPA菌体免疫吸附剂 ;以此免疫吸附提取粪便等病料中的CAV/CPV ,然后直接或经 3 5mol/LMgCl2 将所吸附病毒洗脱后再做PCR。结果 8份经电镜负染或HA/HI试验验证为阳性的粪便样品 ,如此处理后进行PCR检测 ,结果均为阳性 ;而直接取粪便离心后用上清进行PCR检测 ,结果均为阴性。表明该法可有效去除待检样品中的PCR干扰物质 ,提高PCR的检出率。

用抗体致敏SPA菌体浓缩新城疫病毒方法的建立

将金黄色葡萄球菌与灭活的猪抗新城疫病毒(NDV)抗血清混合,37℃感作致敏30min,将致敏的金黄色葡萄球菌加入NDV污染材料洗脱液中,37℃水浴30min,离心洗涤并悬浮菌体于PBS中,取适量用于电镜观察或RTPCR。结果显示,电镜下观察可见NDV吸附到金黄色葡萄球菌表面;经RTPCR对吸附NDV的菌体进行扩增后可见到特异性扩增带。通过条件优化,建立了NDV浓缩方法。用HA效价为29的NDVF48E9毒株尿囊液1∶800、1∶1600和1∶3200稀释液分别喷洒树叶及谷物,采用上述方法浓缩病毒,并经RTPCR检测。结果表明,致敏的金黄色葡萄球菌能够浓缩病毒,提高RTPCR检测的敏感性。

特异抗体致敏的SPA菌体浓缩新城疫病毒方法在临床诊断中的应用

为提高新城疫临床诊断的准确率,建立了新城疫病毒浓缩方法,将粪便及脑、肺等器官组织病料中的新城疫病毒经特异性抗体致敏的金黄色葡萄球菌(SPA菌)吸附浓缩后,用RT-PCR进行检测。结果表明,所建立的新城疫病毒浓缩方法应用于临床诊断后,可显著提高检测敏感性,从而提高临床诊断的准确率。

布鲁氏菌抗体检测试纸条的研制和初步比较

本试验利用胶体金免疫层析技术原理,研制了布鲁氏菌抗体检测试纸条,并以布鲁氏菌阳性血清国家标准品进行了敏感性试验,确定了最低检出量,同时与有可能存在交叉反应的血清和阴性血清进行了特异性试验;然后将保存不同时间的试纸条在进行了敏感性和特异性试验,证明其稳定期可以达到15个月。选择临床牛羊血清30份,利用该试纸条与布鲁氏菌病虎红平板试验抗原进行同步检测,发现两种试剂的检测符合率为98%。试验证明,所研制的布鲁氏菌抗体检测试纸条敏感性高、特异性强、稳定期长。

海水中化学需氧量的流动注射分析法

本发明公开一种动物布鲁氏菌抗体胶体金试纸膜检测试剂盒，根据抗原抗体能特异结合的免疫学基本原理，利用胶体金免疫层析技术和银染加强技术，以重组的金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）作为金标抗体，以高纯度的布鲁氏菌LPS作为包被抗原，利用羊抗牛IgG为质控线制备胶体金试纸条。本发明能够准确区分动物布鲁氏菌病种型，可同时检测牛、羊、猪种动物布鲁氏菌病，且不发生交叉反应，假阳性率低，与常规分离培养的阴、阳性符合率为100％。检测快捷，5min内便可得出结果，不需要复杂的检测仪器为辅助，解决基层单位和普通兽医工作者对动物布鲁氏菌病的普查和病例检测难的问题，特别适合基层医务和兽医工作者使用。

快速ELISA法诊断血吸虫病的应用研究

目的对快速酶联免疫吸附试验(ELISA)的血吸虫病诊断实验条件进行优化,并观察其应用价值。方法同时将抗原、待测血清、HRP-SPA共置进行反应,替代常规ELISA法的分步反应。通过比较不同稀释度HRP-SPA的检测效果,确定其最佳工作浓度。观察待测血清和HRP-SPA不同混合反应时间对检测效果的影响,优化快速ELISA法的检测条件。用快速ELISA法、常规ELISA法和胶体染料试纸条法(DDIA)平行检测慢性血吸虫病人、华支睾吸虫病人及健康人血清,观察快速ELISA法的血吸虫病诊断实用价值。结果 HRP-SPA的最佳工作浓度为1∶2 000,待测血清和HRP-SPA最佳混合反应条件是37℃同步反应60 min。快速ELISA法检测慢性血吸虫病人血清抗体阳性检出率为93.8%,与华支睾吸虫病人血清的交叉反应率为4.0%,检测健康人血清的假阳性率为1.5%,与常规ELISA法和DDIA检测结果相似。结论快速ELISA法具有快速、简便等优点,是一种简便实用的血吸虫病免疫诊断方法。

贝伐珠单克隆抗体的HPLC定量检测方法的建立

目的：建立HPLC-Protein A定量检测贝伐珠单抗的方法,用于该单抗生产过程的含量测定和质量控制。方法：采用Agilent Bio-Monolith Protein A Column（5.2 mm×4.95 mm,0.10 m L）色谱柱,以PBS（含0.12 mol·L-1氯化钠,p H 7.4）为流动相A,0.5 mol·L-1醋酸（p H 2.5）为流动相B。上样后用流动相A冲平,然后用流动相B进行洗脱,流速为1.0 m L·min-1,柱温为25℃,检测波长为280 nm。结果：以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,在0.078-10.0 mg·m L-1浓度范围内,R2〉0.999;回收率在98.32%-101.7%之间;批内精密度RSD≤1.5%;批间精密度RSD≤1.6%;检测限0.30μg,定量限0.90μg;在p H变化±0.2、流动相A中氯化钠浓度变化±10.0%、柱温变化±5.0℃、流速变化±20.0%条件下,峰面积相对标准差RSD为0.39%-1.0%;发酵液样品的保留时间为1.350 min,与对照品的保留时间一致;在18 h内,同一批发酵液共检测27次,峰面积的RSD为0.44%。结论：方法学验证结果显示HPLC-Protein A法可以用于贝伐珠单抗生产过程的含量测定和质量控制。