响应面法优化金钱白花蛇蛋白质的酸提工艺

以金钱白花蛇为原料,通过酸提法提取金钱白花蛇中的蛋白质,以蛋白质得率为指标,在单因素试验基础上通过响应面法优化提取工艺,并对提取物进行指纹图谱分析。结果表明:最佳酸提条件为醋酸钠浓度0.20mol/L、料液比1∶40(g/mL)、提取时间6 h、提取温度45℃,在此条件下蛋白质得率为3.92%。指纹图谱分析表明,酸提法所得金钱白花蛇的蛋白质种类较丰富。

乌梢蛇和金钱白花蛇中43种无机元素含量差异及判别分析

采用微波消解法处理样品,ICP-MS和ICP测定蛇中43种无机元素含量,利用主成分分析、正交偏最小二乘判别分析和线性判别分析对乌梢蛇、酒乌梢蛇、金钱白花蛇、酒炒金钱白花蛇中无机元素含量数据进行统计分析。结果表明:Li、Cr、Mn、Ni、Zr、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Gd、Tb、Dy、Ho和Tm 16种元素在4种蛇样品中相对含量趋势基于一致,4种蛇样品中,乌梢蛇中Cu、Ti含量高,Zn含量低,酒乌梢蛇中V、As、Mo、Cd、Sb、Co、Sr、Ba含量高;金钱白花蛇中Lu含量高,酒炒金钱白花蛇中Ga、Fe、Al含量高,不同蛇样品具有独特的无机元素含量。主成分分析提取的5个主成分,累计方差贡献率为84.38%;主成分分析和OPLS-DA可以完全区分乌梢蛇和金钱白花蛇;线性判别模型对乌梢蛇、酒乌梢蛇、金钱白花蛇、酒炒金钱白花蛇的判别正确率为100%.实验结果证明基于蛇样品中无机元素含量所建立的判别模型可以有效的识别乌梢蛇、酒乌梢蛇、金钱白花蛇、酒炒金钱白花蛇,为蛇的真伪、分类判别提供基础数据和技术支撑。

响应面法优化金钱白花蛇醇溶蛋白提取工艺

以金钱白花蛇为原料,在单因素试验基础上采用响应面法优化其醇溶蛋白提取工艺,并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效液相色谱(HPLC)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)指纹图谱分析。结果表明:最佳提取工艺条件为乙醇体积分数40%、料液比1∶17(g/mL)、提取时间4 h、提取温度40℃,此时醇溶蛋白得率为0.51%。SDS-PAGE指纹图谱分析表明金钱白花蛇醇溶蛋白分子质量主要介于26.69~88.02 kDa,26.69~28.34 kDa和70.84~88.02 kDa处的蛋白质丰度较高,分别占蛋白质总量的55.2%和31.8%;HPLC结果表明,主要金钱白花蛇醇溶蛋白的保留时间为2.928和3.452 min;FTIR结果表明,金钱白花蛇醇溶蛋白在3526.67、2918.31、2357.83、1940.24、1354.05、841.90、546.07和444.52 cm^(-1)处有特征吸收峰。试验结果可为金钱白花蛇醇溶蛋白资源的开发利用及药理活性研究提供依据。

基于DNA条形码的蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及混伪品等32种的鉴别

目的:利用DNA条形码线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因鉴别蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共32种蛇类。方法:收集蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品,对样品DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,扩增产物电泳后进行双向测序。应用Codon CodeAligner11.0.1软件对峰图质量进行比对、拼接,利用MEGA11.0软件对各物种碱基进行分析,构建邻接(NJ)系统聚类树并计算遗传距离。结果:NJ系统聚类树显示,蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共32种均独立聚为一支,眼镜蛇科与蝰科聚为一支,并与游蛇科并列聚类。游蛇科黄环林蛇、颈棱蛇与眼镜蛇科聚为一支,游蛇科赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇与蝰科聚为一支,锦蛇属玉斑锦蛇、黑眉锦蛇、百花锦蛇未聚为一支。结论:利用DNA条形码COⅠ基因能够准确鉴定蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品共32种蛇类,赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇、黄环林蛇、颈棱蛇、玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇、宽吻水蛇、铅色水蛇、中国沼蛇、渔游蛇的种属归类有待进一步研究。

金钱白花蛇碱溶性蛋白质的提取工艺优化及其表征

目的:优化金钱白花蛇碱溶性蛋白质(bmASP)的提取工艺,并对其进行SDS-PAGE、HPLC、FTIR表征。方法:在单因素试验基础上,以提取pH值、料液比、提取时间和提取温度为自变量,bmASP提取率为因变量,基于Box-Behnken组合设计对提取工艺进行响应面优化,对提取产物进行HPLC、FTIR、SDS-PAGE分析。结果:最佳提取工艺条件为:提取pH值为8.0,料液比为1∶40(g/mL),提取时间为5.0 h,提取温度为45℃,bmASP提取率为5.96%。HPLC结果表明bmASP的保留时间为2.998、4.745、4.977、5.672 min;FTIR结果表明bmASP在3 551.45、3 575.95、3 413.06 cm^(-1)等处有特征吸收峰;SDS-PAGE指纹图谱结果表明bmASP分子量介于18.4~116 kDa,其中18.4~19.5 kDa、23.38~25.11 kDa、32.53~38.64 kDa、58.62~65.96 kDa的蛋白质含量丰富。结论:bmASP提取工艺的响应面模型可靠有效,结果稳定,可为金钱白花蛇药效物质基础的研究、资源开发利用及真伪鉴定提供实验依据。

金钱白花蛇及其伪品的Cyt b基因片段序列分析和PCR鉴别研究

对金钱白花蛇及其伪、混品药材和原动物的Ｃｙｔｂ基因片段的序列分析发现，该基因片段在金钱白花蛇及其伪品间的差异远远大于金钱白花蛇种内个体间的差异，是理想的用于鉴别金钱白花蛇及其伪混品的分子遗传标记。在对Ｃｙｔｂ基因片段序列分析的基础上，设计了金钱白花蛇ＰＣＲ鉴别的一对高度特异性引物ＢｕＬ１和ＢｕＨ１。结果表明，该对引物在对金钱白花蛇的ＰＣＲ鉴别中，用６０℃～６５℃的复性温度，可以１００％检出金钱白花蛇，误检率和漏检率为０，并能在混合的药材粉末中检测出被检样品中是否含有金钱白花蛇组份。本研究还表明ＰＣＲ鉴别将有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。

金钱白花蛇及其混淆品高特异性PCR的鉴别

目的:建立一种实用、简便的金钱白花蛇药材DNA分子标记鉴别方法。方法:根据金钱白花蛇及常见混淆品线粒体Cytb基因序列,设计一对专门用于中药材金钱白花蛇的鉴别引物HJL-1和HJH-1。用不同的复性温度PCR扩增,确立特异性反应条件,并利用此方法鉴别从市场中购买的金钱白花蛇药材。结果:在67℃复性温度下进行PCR,正品金钱白花蛇均得到230 bp的扩增带,而混淆品在同样的条件下无扩增带。对市售金钱白花蛇药材随机选取18块进行PCR鉴别验证,其中正品14块,混淆品4块,检出率达100%。结论:设计的鉴别引物对正品金钱白花蛇有高度特异性。可用于市售金钱白花蛇药材的鉴定。PCR稳定性高,同种不同个体间的种内差异对鉴定结果不会有影响。

金钱白花蛇可溶性蛋白凝胶电泳图谱的研究

对金钱白花蛇进行几种凝胶电泳研究 ,根据聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)谱带的位置和数目进行品种鉴别 ;用改进的十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)测定其主要蛋白质成分分子量 ;用等电聚焦电泳(IFE)测定其主要蛋白质成分的等电点 (PI)。清晰的电泳谱带及相应数据为商品蛇真伪鉴别提供了科学依据。

金钱白花蛇商品药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究

目的建立10批金钱白花蛇药材的毛细管电泳指纹图谱。方法超纯水超声提取,以50 mmol/L硼砂-200mmol/L硼酸(pH8.64)作为背景电解质缓冲液,分析在Beckman P/ACE System MDQ高效毛细管电泳仪上进行,柱温25℃,分离电压20 kV,检测波长245 nm,20 min完全分离。结果建立的指纹图谱有9个共有峰,且方法学考察达到标准。结论金钱白花蛇HPCE指纹图谱与蕲蛇和乌梢蛇有明显差别。

基于COI条形码序列的金钱白花蛇及其混伪品的DNA分子鉴定

目的:利用COI序列对金钱白花蛇及其常见混伪品进行DNA条形码鉴别,考察其可行性。方法:对金钱白花蛇及其混伪品共4个种11份样品的COI条形码序列进行研究,分析药材正品来源的种内变异,与混伪品的种间变异,以及系统树中物种的聚类情况。结果:银环蛇COI序列种内变异较小,最大K-2P距离为0.0185,与混伪品的种间序列差异较大,种间最小K-2P距离为0.1561,种间最小K-2P距离远大于种内最大K-2P距离。由所构建的系统聚类树可以看出,同属聚在一起,且各物种又形成相对独立的支,银环蛇COI序列可以明确地与混伪品区分开。结论:运用COI条形码序列能够准确鉴定金钱白花蛇的基源动物及其混伪品,为金钱白花蛇的鉴别提供了新的方法,在其他动物药基源物种鉴定中也具有较大的应用价值。

SDS-PAGE鉴别金钱白花蛇及其混伪品

应用 SDS-PAGE技术对金钱白花蛇(Bungarus multicinctus multicinctus)及其混伪品水赤链游蛇(Natrix annularis)的蛋白质成分进行分析,结果表明,它们的 SDS-PAGE图谱存在明显差异,并由此确定了二者蛋白质成分的分子量,为金钱白花蛇的鉴别提供了依据。

金钱白花蛇抗炎作用的实验研究

金钱白花蛇经药理实验发现对二甲苯所致小鼠耳廓炎症及大、小鼠蛋清性足肿胀在明显抑制作用,证明该药材有良好抗炎作用。进一步实验,发现对摘除肾上腺大鼠蛋清性足肿胀无抑制作用,提示其作用机理可能与垂体——肾上腺皮质系统有关。

金钱白花蛇药酒对佐剂性足跖肿胀大鼠的干预效应

目的:观察金钱白花蛇药酒对急性炎症模型的影响,探讨其作用特点。方法:实验于2002-02/05在河南中医学院动物实验中心完成。①将40只昆明小鼠随机数字表法分为大、小剂量的金钱白花蛇药酒组(分别灌服9,4.5g/kg金钱白花蛇药酒混悬液),枉痹冲剂组(枉痹冲剂混悬液4.5g/kg)和生理盐水组(同体积的生理盐水),每组10只。灌服给药1次/d,连续5d,于最后1次给药后1h,每只鼠右耳涂二甲苯,麻醉后处死小鼠,剪下双耳,用打孔器打下双耳耳片,迅速用分析天平称质量。并计算肿胀度。肿胀度(mg)=右耳质量(mg)-左耳质量(mg)。②将32只SD大鼠随机数字表法分为大、小剂量金钱白花蛇药酒组(9,4.5g/kg),枉痹冲剂组(4.5g/kg)及生理盐水组,每组8只。灌服给药1次/d,连续给药5d,最后1次给药后30min,在每只鼠左、右后足跖皮下注射新配制的100g/L新鲜鸡蛋清液0.1mL,分别于给蛋清后30,60,120,240,360min在足跖测定仪再次测大鼠左右后足跖体积,并计算足跖肿胀率。③将56只SD大鼠随机数字表法分为大、小剂量金钱白花蛇药酒预防组(9,4.5g/kg),大、小剂量金钱白花蛇药酒治疗组(9,4.5g/kg),枉痹冲剂预防组(4.5g/kg),枉痹冲剂治疗组(4.5g/kg)及佐剂模型组(0.5mL佐剂),每组8只。大鼠于乙醚麻醉下,以Freud’s完全佐剂0.05mL注射于右后足垫内,注射佐剂当日即开始给药为枉痹冲剂预防组,第8天开始给药为枉痹冲剂治疗组,1次/d,注射佐剂前及后3h以及间隔一定日期各测左右足趾肿胀程度1次,并观察鼠耳部红斑、尾部结节等出现情况,连续到21d,停药后继续观察3d,第24天麻醉后处死动物称取脏器。结果:纳入雄性昆明种小鼠40只、SD雄性大鼠88只,均进入结果分析。①金钱白花蛇药酒对小鼠耳壳二甲苯致肿的影响:与生理盐水组比较,大剂量金钱白花蛇药酒组和枉痹冲剂组均可显著抑制二甲苯所致小鼠耳壳急性肿胀(P<0.01),小剂量金钱白花蛇药酒组亦可明显抑制二甲苯所致小鼠耳壳急性肿胀(P<0.05)。②金钱白花蛇药酒对大鼠蛋清性足跖肿胀的影响:与生理盐水组比较,大、小剂量金钱白花蛇药酒组和枉痹冲剂组在30～240min均可显著抑制蛋清所致的大鼠足跖肿胀,使肿胀率显著降低(P<0.01);在360min,各给药组亦可明显抑制蛋清所致的大鼠足跖肿胀,使肿胀率明显降低(P<0.05);以大剂量组作用为优。③金钱白花蛇药酒对大鼠佐剂性关节炎的影响:与佐剂模型组比较,金钱白花蛇药酒预防组明显抑制注射局部的早期炎症反应和再度肿胀,又明显抑制另侧迟发性超敏反应性足跖肿胀,作用强度大体上和枉痹冲剂相似(P<0.01,P<0.05)。金钱白花蛇药酒治疗性给药可使注射佐剂侧足肿胀明显消退,并使再度肿胀的程度明显下降,对另侧迟发性超敏反应性足垫肿胀亦有明显的抑制作用(P<0.01,P<0.05)。结论:金钱白花蛇药酒有较好的抗炎作用。

用PCR方法鉴别金钱白花蛇及其伪品

本实验引用一对金钱白花蛇的特异性引物BuL-1和BuH-1,用聚合酶链反应方法(以下简称PCR)对金钱白花蛇、大白花锦蛇、赤链游蛇和蕲蛇等五种蛇样品同时进行扩增、琼脂糖凝胶电泳,并对电泳结果进行分析。结果显示,金钱白花蛇样品扩增产物可见一条230bp的目的片段,而其它四种蛇样品扩增后未见扩增产物出现。本法简单、快速、特异性强、微量。

多重实时荧光PCR鉴别金钱白花蛇源性方法研究

目的用多重实时荧光聚合酶链式反应(多重实时荧光PCR)快速鉴别金钱白花蛇源性。方法以线粒体细胞色素C基因为目标靶基因,根据其特异性核酸序列设计引物和探针,通过优化引物及探针浓度、退火温度等PCR体系和条件,建立从活体材料和粉末制剂等中药材中检测金钱白花蛇源性的二重二色实时荧光PCR检测体系。结果通过检测市售15块金钱白花蛇药材,发现其中5块不含金钱白花蛇源性成分;10份金钱白花蛇粉末制剂中3份未检出金钱白花蛇成分;5份活体样本均为金钱白花蛇。检测结果与DNA测序结果一致。结论本研究建立的方法可用于金钱白花蛇源性的检测,能有效保障金钱白花蛇相关名贵中药及制品的安全性。

金钱白花蛇及其混淆品的粉末鉴定

对金钱白花蛇及其３种混淆品水赤链游蛇、赤链蛇、金环蛇的粉末进行了对比鉴别。并给出了主要特征比较表和检索表。

双波长分光光度法测定金钱白花蛇药酒中士的宁含量

目的 :测定金钱白花蛇药酒中士的宁的含量。方法 :采用双波长分光光度法。结果 :士的宁在 1.6～ 14 .4 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好 ,平均回收率为 99.3 5 % ,RSD为 2 .4 % (n =7)。结论 :该方法可排除其它成分的干扰 ,具有准确可靠 ,重现性好的特点。

金钱白花蛇药酒对小鼠镇痛作用的实验研究

目的:研究金钱白花蛇药酒的镇痛作用。方法:用小鼠热板致病法、小鼠酒石酸锑钾致扭体反应法,观察颈舒康颗粒的镇痛作用。结果:颈舒康颗粒能对抗用热板法、酒石酸锑钾所致的疼痛。结论:颈舒康颗粒有较好的镇痛作用。

金钱白花蛇商品药材中5种有害元素分析

目的:通过对金钱白花蛇商品药材中5种有害元素含量的分析,从有害元素的角度评价其临床使用的安全性。方法:采用微波消解、ICP-MS法测定8批金钱白花蛇商品药材中铅、汞、砷、镉、铜等5种有害元素含量。结果:按2010版《中华人民共和国药典》对有害元素的限量要求,8批金钱白花蛇药材中,镉含量多超标,个别样品的铅、铜含量超标。结论:提示临床使用中,应注意金钱白花蛇药材由有外源性有害元素所引起的毒性。

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法，本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA，用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序，所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列，发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异，因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据，设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下，样品的误检和漏检率为0，能100％地正确区分出正品与伪品药材，此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效，实用性强，该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。