基于三联体和金门克隆的快速TALE模块组装技术

目的:通过降低转录激活因子样效应物(Transcription Activator-Like Effector,TALE)重复,建立新型简单快速的组装方法。方法:利用密码子的简并性,建立含64种组合的三联体非重复序列库。设计一系列PCR引物,其5’端带有Ⅱ型限制性内切酶识别序列。通过PCR扩增TALE三联体,Esp3I酶切获得DNA突出末端按顺序互补配对。所有三联体片段与TALE骨架载体混合后,用金门(Golden Gate)克隆技术进行有序组装,构建获得具有特定DNA靶向能力的TALE表达载体。结果:利用三联体,可通过一步反应实现简单快速TALE的构建,正确组装的效率高。将TALE与脱氨酶融合,再与CRISPR/Cas9系统组合成Ta C9-BE系统,在293T细胞中5个位点实现了高效的单碱基编辑。结论:结合TALE三联体库和金门克隆技术建立了一种新的TALE构建技术——Tri-GG,这种方法具有易操作、成本低、时间短的优势,为TALE在基因编辑的应用提供了一个新的技术途径。