川乌水提取物及其单体成分对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的抑制作用

目的探讨川乌水提取物及其单体成分对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的抑制作用。方法采用转录组测序技术(RNAseq)分析川乌水提取物对金黄色葡萄球菌USA300 hla,psma,isda基因转录水平的影响。采用反转录-实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法测定川乌水提取物及质量浓度分别为0.01,0.1,1 mg/mL的乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱单体成分对hla,psma,isda基因表达水平的影响,采用溶血定量试验考察溶血活性。采用免疫印迹(Western blot)法考察质量浓度分别为0.01,0.1,1 mg/mL的乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱单体成分对金黄色葡萄球菌菌液上清液中α-溶血素分泌的影响。结果USA300经250 mg/mL川乌水提取物处理后,α-溶血素、δ-溶血素、酚溶性调节蛋白等毒力因子相关基因的表达均显著下调(P<0.005)。USA300经250 mg/mL川乌水提取物及1 mg/mL乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱单体成分处理后,hla,psma,isda基因转录水平均受到显著抑制(P<0.05),其中对hla基因的抑制作用最显著;金黄色葡萄球菌的溶血活性均受到显著抑制(P<0.01)。USA300经0.01,0.1,1 mg/mL乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱单体成分处理后,金黄色葡萄球菌菌液上清液中α-溶血素分泌量与乌头原碱呈浓度依赖性降低,但经次乌头碱、新乌头碱单体成分处理后的趋势不明显。结论川乌水提取物及其单体成分可抑制金黄色葡萄球菌中α-溶血素的分泌,尤其是单体成分乌头原碱有用于抗金黄色葡萄球菌感染的潜能。

金黄色葡萄球菌α-溶血素基因表达及溶血活性检测

目的为了进一步研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)α-溶血素(Hla)的分子致病机理及其抗原性,对S.aureusHla进行了表达纯化。方法用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureuswood46株中扩增出hla基因,将该基因经BamHI和SalI双酶切后克隆到表达载体PET-32a中,获得重组质粒pET-32a(+)/hla,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,然后进行纯化和用溶血试验检测其活性。结果扩增的hla基因序列与已发表的hla基因序列同源性为100%,构建的重组表达质粒pET-32a(+)/hla在E.coliBL21(DE3)中得到表达,重组α-溶血素蛋白为53kDa,纯化后的溶血活性为5000HU。结论成功表达并获得了有活性的重组Hla蛋白。

异土木香内酯降低金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达

为了考察异土木香内酯对金黄色葡萄球菌的抗菌活性,并研究其对金葡菌α-溶血素表达的影响,应用肉汤微量稀释法测定异土木香内酯对金葡菌标准株的最低抑菌浓度,采用溶血试验、Western-blot分析和荧光定量PCR分析测定异土木香内酯对金葡菌α-溶血素表达的影响。结果表明,异土木香内酯在2048μg/mL仍然不能抑制金葡菌的生长,然而低浓度(1～8μg/mL)的异土木香内酯能够剂量依赖性地降低金葡菌α-溶血素的表达。该研究提示异土木香内酯可作为以毒力因子为靶标的抗感染药物开发的先导结构。

金黄色葡萄球菌α-溶血素基因的克隆与序列分析

参考Gary S Gray和Michael Kehce在《传染与免疫》杂志上发表的关于金黄色葡萄球菌α溶血素蛋白的基因序列,设计合成1对引物,从分离自牛体的野生株金黄色葡萄球菌中提取细菌总DNA,对α溶血素蛋白基因进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现1条约960 bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18 T质粒载体中,进行核苷酸序列分析,然后与报道的α溶血素蛋白基因进行比较。结果表明:所鉴定的野生株金黄色葡萄球菌的α溶血素蛋白基因序列与报道的核苷酸的同源性高达99.99%以上,证实为金黄色葡萄球菌Wood 46株α溶血素蛋白基因。

黄芩提取物抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性的研究

α-溶血素(αHL)是金黄色葡萄球菌(S.aureus)重要的毒力因子,为研究黄芩醇提物对αHL溶血活性的抑制作用,本研究通过乙醇回流提取法获得黄芩醇提取物,测定其对S.aureus的最小抑菌浓度(MIC)、对αHL表达和生物学活性的影响以及对αHL介导的A549细胞损伤的保护性作用。试验结果显示,黄芩醇提取物对所测试的S.aureus的MIC均高于2 048μg/mL;黄芩醇提取物能够抑制S.aureus培养物上清中的αHL的溶血活性,并呈浓度依赖关系,但对αHL的表达并无抑制作用;而且黄芩醇提取物也能够呈剂量依赖关系缓解S.aureusαHL介导的对A549细胞损伤作用。该结果表明黄芩醇提取物能够以某种形式导致αHL丧失生物活性,并提示黄芩醇提取物是一种潜在的抗S.aureus感染的复合物。

亚抑菌浓度穿心莲提取物对减缓金黄色葡萄球菌α-溶血素介导的A549细胞损伤作用的影响

金黄色葡萄球菌是一种广泛存在的重要致病菌,可引起人类和动物许多严重的感染。另外,α-溶血素是金黄色葡萄球菌最重要的毒力因子之一。本研究通过乙醇回流提取方法,获得中草药穿心莲提取物,然后通过最低抑制浓度(MIC)值测定、溶血活性测定、Western blotting、RT-PCR、LDH及Live/dead等方法研究分析穿心莲提取物对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的影响及对A549细胞的保护作用。试验结果表明,穿心莲提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值为2048μg/mL,且呈剂量依赖性地抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌,并能有效减缓金黄色葡萄球菌菌液上清对A549细胞的损伤。提示,穿心莲提取物是一种潜在的抗金黄色葡萄球菌感染的药物。

亚抑菌质量浓度的百里香酚对金黄色葡萄球菌α-溶血素表达的影响

【目的】α-溶血素在金黄色葡萄球菌(金葡菌)肺炎的感染过程中起着非常重要的作用,可作为治疗金葡菌肺炎的新靶标。因此,研究百里香酚对金葡菌α-溶血素表达的影响具有重要意义。【方法】测定最小抑菌质量浓度(MIC)和生长曲线并进行了溶血试验、蛋白免疫印迹分析、荧光定量PCR以及细胞毒性试验。【结果】百里香酚对金葡菌USA300的MIC为256μg/mL,亚抑菌质量浓度的百里香酚(32μg/mL)可下调金葡菌hla和RNAIII的转录水平,降低α-溶血素的表达,对溶血素介导的肺癌上皮细胞A549损伤具有保护作用。【结论】百里香酚具有成为新型抗金葡菌感染药物的潜力。

定点突变阻止金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性

金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基因组中扩增出α-hla基因,再利用重叠延伸PCR技术,将第35位带正电荷的组氨酸(密码子为CAC)突变为非极性的亮氨酸(密码子为CTC)。hlaH35L基因测序结果显示第35位的组氨酸突变为亮氨酸,构建的重组表达质粒pET-28a-c(+)/hla和pET-28a-c(+)/hlaH35L在E.coli BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白α-Hla及hlaH35L大小均为33.4 kDa,α-Hla引起兔红细胞溶血,hlaH35L未引起兔红细胞溶血。成功表达并获得了失去溶血毒性的重组蛋白hlaH35L。

亚抑菌浓度鱼腥草醇提物对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的影响研究

为了研究鱼腥草醇提物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性以及其对金葡菌α-溶血素分泌的影响。通过最低抑菌浓度的测定并应用溶血试验、Western-blot分析、荧光定量PCR试验以及细胞毒性试验考察亚抑菌浓度的鱼腥草醇提物对金葡菌α-溶血素分泌的影响。结果表明：鱼腥草醇提物对9株金葡菌的最小抑菌浓度范围为16~64mg/mL,亚抑菌浓度鱼腥草醇提物呈剂量依赖式抑制金葡菌α-溶血素的分泌,尤其当浓度为0.16mg/mL时,基本上能完全抑制金葡菌α-溶血素的分泌。本研究可能为抗金葡菌感染提供一种新的策略。

金黄色葡萄球菌α-溶血素亚单位疫苗在小白鼠模型的免疫效力评价

目的:以小白鼠为试验模型,检测金黄色葡萄球菌α-溶血素基因工程蛋白单位疫苗的抗体效价水平和免疫保护力,初步评价此亚单位疫苗的免疫效力。方法:Bradfrod法对目的蛋白进行蛋白含量测定,Geoffroy法测定目的蛋白半数溶血效价和活性,建立ELISA方法测定抗体效价,并且通过攻毒得出疫苗免疫保护力。结果:纯化的目的蛋白在53kDa处显示单一条带,蛋白含量为0.1278mg/ml;溶血比活为8012.5HU/mg;所有试验小鼠在首免一周后采集的血清中都检测到了特异性抗体,而抗体效价开始时呈逐渐上升趋势,达最高值后随时间延长逐渐降低。结论:纯化的目的蛋白达到电泳级纯度,且依然保持良好的黏附活性,蛋白疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律。

金黄色葡萄球菌β-溶血素的原核表达及其溶血活性检测

目的为进一步研究金黄色葡萄球菌β-溶血素的致病性及免疫保护作用,对金黄色葡萄球菌β-溶血素进行了表达。方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从金黄色葡萄球菌中扩增出β-溶血素基因,将该基因克隆到原核表达载体PET-32a中,获得重组质粒PET-32aβ-,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Westernblot检测分析,并对纯化后表达产物进行平板溶血试验,检测其溶血活性。结果PCR扩增的β-溶血素基因片段全长为982bp;表达的β-溶血素重组蛋白大小为57kD;纯化的重组蛋白可使绵羊红细胞发生明显溶血。结论结果表明所克隆的β-溶血素基因在大肠杆菌中得到了良好的表达,并保持良好的溶血活性。

牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(hlb)的克隆、表达及溶血活性分析

【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103HU·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。

中草药连翘提取物抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌活性研究

通过乙醇回流提取获得中草药连翘粗提物,利用MIC值测定、溶血活性测定、免疫印迹、RT-PCR、LDH及live/dead等试验方法研究连翘提取物对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的影响。结果表明:连翘提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度(MIC)均大于2 048mg/L,表明连翘提取物不影响金黄色葡萄球菌生长。连翘提取物在16～128mg/L时,抑制了金黄色葡萄球菌α-溶血素的分泌,而且这种抑制作用呈剂量依赖性。研究结果提示连翘提取物可作为一种潜在的抗金黄色葡萄球菌感染药物,可进一步开发。

蜂胶对金黄色葡萄球菌α-溶血素的抑制作用

通过吸光度测量和荧光定量PCR的方法,在体外检测亚抑菌浓度的蜂胶作用下金黄色葡萄球菌α-溶血素活力变化及agrA、hla的mRNA表达量。结果显示,不同浓度蜂胶对金黄色葡萄球菌α-溶血素有不同程度的抑制作用(P<0.05);同时荧光定量PCR检测agrA和hla基因表明,蜂胶能够显著减少agrA和hla mRNA的相对表达量,进而抑制α-溶血素的表达。

牛金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸和1个终止子的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示,克隆的金葡菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶。上述结果显示,已获得金黄色葡萄球菌β-溶血素基因,为获得重组金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。

金黄色葡萄球菌α-溶血素及其突变体的原核表达和免疫学活性

目的原核表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)α-溶血素(α-hemolysin,Hla)及其突变体,并检测其免疫学活性。方法采用PCR法从S.aureus中扩增hla基因,将该基因克隆至原核表达载体p ET28a中,构建重组表达质粒p ET28a-hla,并利用点突变试剂盒进行突变,获得重组质粒p ET28a-hlaH35L。将两种重组表达质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经Ni-NTA亲和层析和CM离子交换层析纯化后,检测其溶血活性、免疫血清的抑制溶血活性及HlaH35L蛋白的免疫保护作用。结果重组表达质粒p ET28a-hla经双酶切和测序证明构建正确;重组质粒p ET28a-hlaH35L的测序结果显示,第35位氨基酸突变位点与设计相符。表达的Hla和HlaH35L蛋白相对分子质量约为36 000,均为可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度均在90%以上。Hla具有溶血活性,溶血比活为152 HU/mg;HlaH35L无溶血活性;抗Hla和抗HlaH35L血清均具有抑制Hla溶血的活性;在小鼠滴鼻攻击模型中,HlaH35L具有一定的保护作用。结论成功在大肠埃希菌中表达了具有良好免疫学活性的Hla及其突变体HlaH35L,为筛选S.aureus候选疫苗组分奠定了实验基础。

金黄色葡萄球菌α-溶血素的研究进展

金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）分泌多种与致病相关的毒素,α-溶血素是其中最主要的一种,它被认为是金葡菌感染引起皮肤坏死和严重感染的主要毒力因子.α-溶血素的名称来源于其能够溶解红细胞的特性,但是其细胞特异性范围很广,作用机制也十分复杂,对不同的宿主细胞所引发的致病反应也各不相同.本文总结了近年来有关α-溶血素结构及其与不同宿主细胞相互作用的研究,以利于我们更好地理解α-溶血素在金葡菌感染过程中所发挥的作用,为开辟金葡菌感染防治的新途径提供参考.

奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及原核表达

以提取的奶牛乳腺炎源性金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)全基因组DNA为模板,PCR扩增β-溶血素基因(hlb),并与克隆载体pMD18-T相连接。测序结果表明,扩增片段含有993bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸同源性为99.4%。构建原核表达载体pET32a+/hlb,SDS-PAGE分析蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白的相对分子量质为57000,表达量占菌体总蛋白的23.9%;表明原核表达质粒构建成功,并实现了有效表达。

Ph-SA对金黄色葡萄球菌δ溶血素分泌影响的初步研究

目的 通过检测Ph- SA作用后,金黄色葡萄球菌δ溶血素分泌的变化,初步探究Ph- SA的作用机理。方法 实验分未处理、Ph- SA处理、青霉素处理三组,当菌的光吸收值A595达到0 .2时,加入相应的药物,分时段采集样品,用高效液相色谱法检测样品中δ溶血素的分泌量。结果 同一时间点比较,Ph- SA处理组δ溶血素分泌量明显低于其他两组(P均<0 .0 5 )。结论 Ph- SA除了形成孔道杀菌外,还可能具有抑制agr系统而降低细菌外毒素分泌的作用。