耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因检测与耐药性分析

目的采用实时荧光PCR检测耐甲氧西林金葡菌(MRSA)杀白细胞素(PVL)基因,并分析其对抗菌药物敏感性,指导临床合理用药。方法采用双重实时荧光PCR技术对血液和脓液分离的40株MRSA进行PVL基因检测,并对PVL基因阳性菌株感染患者的临床资料进行分析;VITEK2-compact全自动微生物测试仪进行药敏试验。结果 40株MRSA检出7株PVL基因阳性,阳性率17.5%,PVL基因阳性菌株所致的感染分别为坏死性皮肤软组织感染3例,血流感染3例和乳腺脓肿1例。MRSA携带或不携带PVL基因菌株的药敏试验结果有所不同,未检出对万古霉素不敏感菌株。结论 MRSA携带或不携带PVL基因对抗菌药物敏感性有差异,本地区MRSA-PVL基因阳性率较高,应加强监测。

金黄色葡萄球菌杀白细胞素的研究进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）普遍存在,是导致医院和社区感染的重要病原菌。MRSA最早出现在医院内呼吸道感染中,随着时间的推移,逐渐向院外扩散,社区相关性MRSA（communityassociated MRSA,CA-MRSA）成为院外感染的重要病原菌。有研究者发现,几乎所有CA-MRSA存在杀白细胞素（pantonvalentine leucocidin,PVL）[1-4]。

74例金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因检测

杀白细胞素（panton-valentine leukocidin,PVL）是金黄色葡萄球菌的一种重要致病因子,可以引起毛细血管扩张、趋化效应、多形核白细胞渗出、核破裂、皮肤坏死等[1]。本文采用PCR法对临床分离的金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因进行检测,旨在探讨PVL的表达与临床感染的相关性。

亚抑菌浓度的抗生素对金黄色葡萄球菌杀白细胞素表达及释放的影响

目的：观察亚抑菌浓度抗生素对金黄色葡萄球菌（金葡菌）杀白细胞素（PVL）表达的影响。方法利用 PCR筛选出8株 PVL 阳性金葡菌。常量稀释法测定克林霉素、替加环素、利奈唑胺和万古霉素最低抑菌浓度值（MIC）；荧光定量 PCR 测定前3种抗生素对 PVL 阳性金葡菌在1/8、1/4、1/2 MIC 作用下 PVL mRNA 相对变化。 ELISA 法测定4种抗生素1/4、1/2 MIC 时 PVL 蛋白含量。结果克林霉素、利奈唑胺和替加环素在1/8、1/4、1/2 MIC 时均可降低 PVL表达。 PVL mRNA 在3种抗生素作用下分别降低17%～82%、8%～85%和11%～78%；PVL 蛋白水平在1/4、1/2 MIC 克林霉素和利奈唑胺作用下，分别下降了65%和83%、40%和61%，替加环素仅1/2 MIC 时降低较明显，达64%。万古霉素不影响 PVL 表达。结论不同抗生素亚抑菌浓度时对 PVL 表达影响不同。克林霉素和利奈唑胺可明显降低PVL 表达，且呈剂量依赖性，替加环素只在较高浓度时抑制PVL 表达，万古霉素对 PVL 表达无影响。

影响金黄色葡萄球菌杀白细胞素ED转录表达的培养条件

为探讨影响金黄色葡萄球菌杀白细胞素ED(leukocidin ED,LukED)转录表达的最佳培养条件,采用定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测金黄色葡萄球菌Newman菌株lukE在TSB、BHI、YCP、MHB和LB培养基中不同生长阶段(对数生长早期、中期、晚期和平台期)的表达情况。以表达量较低的培养基为基础,分别加入表达量最高的培养基的不同成分,分析促进lukED表达的物质。结果显示,lukE mRNA水平在YCP培养基中生长至对数晚期时表达最高;YCP组分酵母浸出物、酪蛋白氨基酸及丙酮酸钠均能显著促进lukE转录表达,前两者效果更好。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因检测

目的调查临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)杀白细胞毒素基因携带率。方法收集非重复MRSA菌株83株,按照美国疾病预防控制中心的CA-MRSA 定义分为HA-MRSA和CA-MRSA两组。采用多重PCR法进行SCCmec分型,普通PCR+测序法进行spa分型,普通PCR检测杀白细胞素(PVL)基因。结果83株MRSA中HA-MRSA、CA-MRSA分别占47.0%、53.0%,SCCmec分型中SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳa型和未分型各占1.2%、3.6%、65.1%、28.9%、1.2%,spa分型中83株MRSA共检出15个型,主要分型为t437,t062,t015分别占39.8%, 21.7%,10.8%;PVL阳性的MRSA中HA-MRSA和CA-MRSA分别10.3%、36.4%,两者差异有显著性(P=0.006);33株spa t437中有18株携带PVL基因,阳性率54.5%,50株其他spa分型中仅2株携带PVL基因,阳性率4.0%,两者差异有显著性(P=0.000)。PVL基因阳性的MRSA特征CA-MRSA-Ⅳa-t437 9株,HA-MRSA-Ⅲ-t437 4株,HA-MRSA-Ⅳa-t437 3株;20株PVL基因阳性的MRSA中10株分离自皮肤软组织感染病例,6株分离于耳鼻喉科感染病例,3株分离于呼吸道感染病例,1株分离于败血症病例。结论CA-MRSA菌株较HA-MRSA菌株的 PVL基因阳性率更高,同时也发现携带有更高毒力的CA-MRSA的克隆已经播散到医院的环境中,引起医院获得性相关感染。

金黄色葡萄球菌杀白细胞素ED的研究进展

杀白细胞素ED(leukocidin ED,LukED)是金黄色葡萄球菌产生的双组分成孔杀白细胞素之一,由共转录于一条mRNA的lukE和lukD两个基因编码。LukED可与趋化因子受体CCR5结合以杀伤巨噬细胞、T细胞和树突细胞,或与中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤(natural kiler,NK)细胞上的表面受体CXCR1/2结合以促进金黄色葡萄球菌的致病性及系统性感染宿主的死亡。此外,LukED还可结合Duffy抗原趋化因子受体,使裂解红细胞释放血红蛋白,促进细菌的铁吸收和生长繁殖。LukED的表达受双组分信号转导系统附属基因调节子——毒素抑制子(Agr-Rot)通路和转录调节子RpiRc、SpoVG的调控。lukED基因在金黄色葡萄球菌中广泛流行,与金黄色葡萄球菌所致血流感染、脓疱病及抗生素相关性腹泻密切相关。这些进展对了解LukED的表达调控机制、临床意义及其在细菌致病机制中的作用,开发新的金黄色葡萄球菌感染抗毒素治疗药物具有重要意义。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因亚型的流行及MLST分子分型

目的探讨临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)杀白细胞素(pvl)基因亚型的流行及MLST分子分型特征。方法收集非重复MRSA 287株,按照美国疾病预防控制中心的社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)定义分为医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)和CA-MRSA两组。采用PCR方法扩增pvl基因,产物双向测序并分析核苷酸变异情况;pvl基因阳性(pvl^(+))菌株进行多位点序列(MLST)分型并采用eBURST软件进行克隆复合群(CC)分析。结果287株MRSA中,51株为pvl^(+)菌株(17.8%,51/287),其中29株为CA-MRSA(56.9%,29/51),22株为HA-MRSA(43.1%,22/51)。pvl^(+)菌株经双向测序共发现4个位点(527、663、1396和1729)存在核苷酸变异,根据527位点的差异分为H(H1和H2)和R(R1和R2)亚型。其中46株(90.2%,46/51)为H型(6株H1、40株H2),5株(9.8%,5/51)为R型(1株R1、4株R2)。H型主要属于CC59(ST59/ST388)(69.6%,32/46),其次为CC22(ST22)(10.9%,5/46),CC1(ST1/ST188)(6.5%,3/46)、CC88(ST88)(4.3%,2/46)、CC5(ST149)(4.3%,2/46)、CC9(ST9)(2.2%,1/46)和CC30(ST30)(2.2%,1/46);仅在CC59(ST59)、CC88(ST88)和CC5(ST25)型菌株中发现R型。CA株和HA株携带的pvl均以H亚型为主,分别占86.2%(25/29)和95.5%(21/22),两组差异无统计学意义。结论本地区临床分离MRSA携带的pvl以H亚型(H2)为主,主要克隆型别为CC59;CA-MRSA和HA-MRSA携带的pvl亚型没有明显差异。

C5aR在金黄色葡萄球菌LukS-PV诱导非小细胞肺癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨金黄色葡萄球菌杀白细胞素S组分(LukS-PV)通过活化补体5受体(C5aR)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞A549和H460凋亡的影响。方法:将敲低C5aR表达的慢病毒载体转染至A549和H460细胞中,qRT-PCR和Western blot检测C5aR敲低率,Annexin V/PI染色法检测敲低C5aR对细胞凋亡的影响。对敲低C5aR的细胞再加入LukS-PV,通过Annexin V/PI染色法和凋亡相关蛋白检测细胞凋亡情况。结果:与PBS对照组相比,LukS-PV可促进A549和H460细胞凋亡(P<0.05)。慢病毒载体转染A549和H460细胞敲低C5aR后,细胞C5aR表达水平降低(P<0.05)。在敲低C5aR基础上再加入LukS-PV,细胞凋亡受到抑制(P<0.05)。结论:敲低C5aR可抑制LukS-PV诱导NSCLC细胞的凋亡。

夫西地酸联合黄芩素对金黄色葡萄球菌的体内外抗菌作用研究

目的研究夫西地酸(fusidic acid,FA)联合黄芩素(baicalein,BE)在体内和体外对13株金黄色葡萄球菌的抗菌特性。方法采用微量肉汤稀释法和微量棋盘法测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)。采用FICI评价综合效果,采用时间-杀菌曲线法测定杀菌效果。利用琼脂二倍稀释法对5株金黄色葡萄球菌的防耐药突变浓度(mutant prevention concentration,MPC)和防耐药突变选择窗(mutant selective window,MSW)进行测定,比较夫西地酸单独应用及联用黄芩素后防耐药突变窗的变化。使用金黄色葡萄球菌感染肺炎小鼠模型进行体内实验,测定FA和BE单独和联合治疗后生命体征、肺脏指数、菌落定植数和血清炎症因子的变化。结果研究发现,FA与BE组合的协同效应为53.8%,相加效应为30.8%,无关效应为15.4%。此外,研究人员观察到,当FA与BE以特定浓度(分别为1MIC和1/2MIC)结合时,在24h后对3株金黄色葡萄球菌(SA-ATCC29213、MRSA-ATCC43300和MRSA-210702212)均有杀菌作用。FA对这些菌株的MPCs为128~256μg/mL,而MSWs为64~256μg/mL。而当BE加入混合物时,菌株的MPCs降低到16~32μg/mL,MSWs降低了8~16倍,说明BE提高了FA对这些菌株的抗菌活性。FA和BE的组合对金黄色葡萄球菌肺炎小鼠的生命体征影响很小。小鼠肺脏指数、肺部金黄色葡萄球菌定植数、血清中炎症因子等实验结果表明,FA和BE组合对金黄色葡萄球菌的影响很小,但联合用药组对小鼠肺炎的治疗效果明显优于单药组。结论FA单独应用时,MSW较宽,联用BE后,FA的MSW明显缩小。FA联合BE有协同杀菌效应,治疗小鼠金葡菌肺炎效果较单药组好。

多重PCR对金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因的检测

目的应用多重PCR检测含Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)基因的金黄色葡萄球菌。方法收集我院2005年1月至2006年1月从临床多种标本中分离的金黄色葡萄球菌,用多重PCR同时检测葡萄球菌16S rRNA基因、mecA基因和lukS／F-PV基因。多重PCR检测MRSA的SCCmec基因型及亚型。结果195株金黄色葡萄球菌经多重PCR检测,121株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),74株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),共检测到26株金黄色葡萄球菌lukS／F-PV基因阳性,阳性率为13．3％(26／195)。其中19株为MRSA,阳性率为15．7％(19／121);7株为MSSA,阳性率为12．2％(7／74)。19株lukS／F-PV基因阳性的MRSA的SCCmec基因型分别为SCCmecIII型10株、SCCcecIIIA型4株、SCCmecIV型4株及SCCmec I型1株。26株lukS/F-PV基因阳性的分离株有11株分离自脓液或创面分泌物,10株分离自痰标本,3株分离自血液标本,2株分离自尿液。结论在温州地区分离的MRSA和MSSA中都能检测到Panton-Vatentine杀白细胞素基因,含Panton-Valentine杀白细胞素基因MRSA的SCCmec基因型主要为SCCmecⅢ,含PVL基因的金黄色葡萄球菌主要引起化脓性感染和肺部感染。

金黄色葡萄球菌所致肺部感染的耐药特点及其Panton-Valentine杀白细胞素基因的携带状况分析

目的分析金黄色葡萄球菌所致肺部感染的耐药性特点及其Panton-Valentine杀白细胞素基因的携带状况。方法回顾性调查了温州医学院第一附属医院2005年1月至2006年1月医院感染的金黄色葡萄球菌所致肺部感染患者132例,对其体外药敏试验进行分析;并利用多重PCR检测其PVL基因,应用多位点基因序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术对PVL基因阳性的菌株进行序列分型。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的SCCmec基因分型采用多重聚合酶链反应。结果致肺部感染的132株金黄色葡萄球菌的耐药现象较为严重,仅对万古霉素、呋喃妥因及复方新诺明等药物的敏感率较高;其中经多重PCR筛选出10株携带PVL基因的金葡菌,全部为MRSA菌株,3株为ST239-SCCⅢ,2株为ST398-SCCmecⅢ,2株为ST398-SCCmecⅣ,ST25-SCCmecⅢ、ST59-SCCmecⅠ和ST88-SCCmecⅢ各1株。结论肺部感染的金黄色葡萄球菌对多种抗生素耐药,呈多重耐药性;其携带PVL基因占一定比例。

金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因的检测

由于金黄色葡萄球菌可产生多种毒素，致病性较强，常引起化脓性感染、食物中毒、疖病、肺炎、化脓性关节炎、骨髓炎、心内膜炎及脓毒血症等。1961年出现第1株MRSA以来，在全球范围内都有由MRSA引起感染的报道，MRSA是医院感染的主要病原菌，且多呈多重耐药性。

杀白细胞毒素基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的红霉素耐药基因的检测

目的了解杀白细胞毒素(PVL)基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MR-SA)的红霉素耐药基因(ermA/B/C)检出情况。方法收集2007年1月—2008年6月分离自河北医科大学第一医院临床患者的MRSA 45株,采用聚合酶链反应对45株MRSA的ermA/B/C和PVL基因进行检测,分析PVL基因阳性MRSA的ermA/B/C检出率。结果45株MRSA中有33株检出ermA/B/C,检出率为73%(33/45);有12株检出PVL基因,检出率为27%(12/45);12株PVL基因阳性MRSA中有9株检出ermA/B/C,检出率为75%(9/12);33株PVL基因阴性MRSA中仅24株检出ermA/B/C,检出率为73%(24/33)。结论PVL基因阳性与PVL基因阴性MRSA的ermA/B/C检出率基本一致,MRSA的重要致病基因——PVL的产生可能与红霉素耐药基因ermA/B/C无关。

国内杀白细胞素阳性金黄色葡萄球菌感染的研究现状

金黄色葡萄球菌是临床引起感染性疾病最常见的病原菌之一，它的致病性与其携带的多种毒素因子有关。携带毒素因子的金黄色葡萄球菌毒力更强，与感染后疾病的严重程度呈正相关，产毒素菌株所造成的感染重、病程长，加大治疗难度和护理难度，同时增加了患者的痛苦和经济负担。杀白细胞素（PVL）是金黄色葡萄球菌产生的一种重要外毒素，

杀白细胞素基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药性分析

目的了解杀白细胞素(PVL)基因阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的耐药情况,指导临床合理用药。方法对临床收集的47株PVL基因阳性MRSA采用PCR法检测PVL基因,采用纸片扩散法进行药敏试验,并对结果进行分析。结果 47株MRSA的PVL基因检出率为46.8%,PVL基因阳性、阴性MRSA对β-内酰胺类抗菌剂均100.0%耐药,PVL基因阳性MRSA对氨基糖苷类、利福平、四环素、红霉素、环丙沙星、亚胺硫霉素等抗菌剂全部耐药,对盐酸克林霉素的耐药率为95.5%;PVL基因阴性MRSA对上述抗菌剂的耐药性虽比PVL基因阳性MRSA轻,但耐药率也在88.0%以上,2组间耐药性比较,差异有统计学意义(P<0.05)。对复方新诺明敏感率在90.0%以上,未发现对万古霉素耐药株。结论 PVL基因阳性MRSA在临床检出率已较高,耐药性严重并呈多重耐药特征,增加了临床抗感染治疗的难度。

老年病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌葡萄球菌染色体mec基因盒基因型和杀白细胞素基因的检测及特点

目的了解复旦大学附属华东医院老年科临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)葡萄染色体mec基因盒(SCCmec)的分布和杀白细胞毒素(PVL)基因的携带状况。方法收集复旦大学附属华东医院老年科病房2011年2—7月从临床标本中分离的不重复MRSA共57株。运用多重聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌16SrRNA基因、PVL基因和mecA基因,并同时检测SCCmec的基因型及亚型。采用琼脂稀释法进行13种药物的药物敏感试验。结果 57株MRSA中,SCCmecⅠ型1株(1.8%),SCCmecⅠA型5株(8.7%),SCCmecⅡ型30株(52.6%),SCCmecⅢ型15株(26.3%),SCCmecⅢA型2株(3.5%),4株(7.0%)未能分型。57株MRSA中,PVL基因均为阴性。MRSA菌株最敏感的药物为万古霉素和利奈唑胺(敏感率均为100.0%),其次为呋喃妥因和甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑(98.2%、96.5%)。结论复旦大学附属华东医院老年科临床分离的MRSA呈多重耐药,其SCCmec型别主要以SCCmecⅡ型和SCCmecⅢ型为主,未发现PVL基因阳性菌株。

表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1单核细胞自噬和凋亡

目的研究表达Panton-Valentine杀白细胞素(PVL)的金黄色葡萄球菌诱导人THP-1细胞自噬和凋亡机制。方法在大肠杆菌中表达重组杀白细胞素(rPVL),并免疫家兔制备多克隆抗血清。采用反转录PCR和Western blot法鉴定表达PVL的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。分别使用表达PVL的MRSA(MRSA^(PVL+))和不表达PVL的MRSA(MRSA^(PVL-))感染THP-1细胞,于感染后1、3、6 h收集细胞,采用实时定量PCR检测自噬相关基因3(ATG3)、ATG4B、ATG5、ATG7、ATG12;Western blot法检测beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、caspase-3的蛋白水平;二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针负载法检测细胞活性氧(ROS)水平;异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶(annexinⅤ-FITC/PI)双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功制备PVL多克隆抗体,鉴定出1株MRSA^(PVL-)菌和1株MRSA^(PVL+)菌。分别以两株菌与THP-1细胞共培养1 h,MRSA^(PVL+)组仅ATG7表达量显著高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组;共培养3 h,MRSA^(PVL+)组ATG7和ATG12表达量高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组,其他基因表达量变化不明显。感染1、3、6 h,MRSA^(PVL+)感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于MRSA^(PVL-)感染组和正常对照组;感染1 h和3 h,MRSA^(PVL-)感染组细胞PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组;感染6 h,MRSA^(PVL-)菌感染组细胞mTOR磷酸化水平显著低于正常对照组。感染1、3、6 h,MRSA^(PVL+)组细胞ROS水平和凋亡率均高于MRSA^(PVL-)组和正常对照组,且随着感染时间的延长细胞ROS水平和凋亡率持续增加;MRSA^(PVL-)组细胞ROS水平和凋亡率也高于正常对照组。结论MRSA^(PVL+)对THP-1细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制作用更强,可促进ATG12/ATG7/ATG5自噬通路活化增加THP-1细胞自噬;同时,MRSA^(PVL+)诱导THP-1细胞ROS产生增加,促进细胞凋亡。

金黄色葡萄球菌Panton-Valentine杀白细胞素的研究进展

由金黄色葡萄球菌产生的Panton-Valetine杀白细胞素可导致白细胞凋亡和坏死,已成为该细菌的一个致病因素。临床发现由PVL阳性金黄色葡萄球菌所致的感染病情复杂,死亡增多。针对目前PVL的分子生物学特点、作用机制、靶细胞、临床分布及意义的研究进展进行了综述。