金黄色葡萄球菌核酸酶A在温控双表达载体中的表达及其活性分析

菌蜕制备时,金黄色葡萄球菌核酸酶A(Staphylococcal nuclease A,SNA)在温控单表达系统中表达时,对宿主菌的灭活效率比其在双表达系统中与基因E共表达时的灭活效率高近一个数量级。为探究导致这种差异的可能机制,将SNA克隆至一温控双表达载体进行诱导表达并对其活性进行综合分析。结果显示,胞内和胞外产物均具有核酸酶活性,分别在升温诱导30 min和90 min后被检出,对宿主菌的4 h灭活率为99.7%,宿主基因组亦被成功降解。这表明,SNA在温控双表达载体中的表达仍能如在单表达载体中一样有效灭活细菌,裂解基因E和SNA的共表达可能才是造成上述差异的主要原因。

金黄色葡萄球菌核酸酶对2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎的保护作用

探究金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导小鼠结肠炎的改善作用及机制。用2.5%TNBS溶液灌肠雌性BALB/c小鼠建立结肠炎模型,并连续6 d灌胃给予以重组乳酸菌为递呈载体的SNase。探究SNase介导的中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的降解对小鼠结肠炎的影响。实验分为正常组、TNBS模型组、NZ9000乳酸菌组、表达SNase的重组乳酸菌组。每日观测小鼠体质量、粪便性状和粪便隐血情况,观察期结束取结肠组织进行HE病理分析,检测结肠组织髓过氧化物酶(MPO)酶活和促炎细胞因子的mRNA表达水平,检测血清炎性细胞因子含量,同时免疫组化检测结肠组织中性粒细胞及其NETs标志物的表达水平。结果表明,乳酸菌递呈的SNase能缓解TNBS诱导的结肠炎小鼠体质量下降,降低疾病活动指数(DAI)评分,缓解结肠缩短并减轻病理损伤,降低结肠组织MPO酶活及炎性细胞因子表达,同时改善了血清炎性水平,免疫组化结果表明结肠组织Ly6G和citH3水平下降。初步机制表明,SNase能够下调炎性细胞因子的表达,降低NETs水平从而缓解小鼠结肠炎。

金黄色葡萄球菌核酸酶C末端去9肽对酶蛋白溶液构象的影响

通过多维异核核磁共振方法,结合运用荧光和圆二色等光谱方法,比较研究了V8菌株金黄色葡萄球菌核酸酶(含149个氨基酸残基),酶蛋白1～140片段(SNase140)以及在TMP(thymidine 5’-monophosphate)和Ca^(2+)存在下的SNase140的溶液构象状态。探讨了酶蛋白C末端去9肽后对酶蛋白构象和活力的影响。研究指出,远离酶蛋白活性部位残基间相互作用的变化,将通过酶蛋白两个亚结构域之间所形成的氢键,影响酶蛋白活性部位的空间构象,从而影响酶蛋白的活力。

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 Δnuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2Δnuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220Δnuc1。

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 △nuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcalnuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2△nuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220△nuc1。

金黄色葡萄球菌核酸酶N末端片段的折叠研究

采用一维１ＨＮＭＲ谱和二维１ＨＮＯＥＳＹ谱对金黄色葡萄球菌核酸酶Ｎ末端片段ＳＮＲ１２１与ＳＮＲ１３５进行了定性研究。通过对化学位移分布、ＮＯＥ等ＮＭＲ参数进行的分析，指出两个Ｎ末端片段均含有一定数量的二级结构。在ｐＤ值为５．４时ＳＮＲ１３５即有稳定的反平行β片层存在，而ＳＮＲ１２１只是在ｐＤ７．０下才可观察到稳定的反平行β片层的存在。本文同时还研究了ｐｄＴｐ、Ｃａ２＋以及胍对ＳＮＲ１２１结构的影响，指出该肽段仍具有折叠回天然状态的能力。

金黄色葡萄球菌核酸酶及其突变体酶动力学性质的比较

将金黄色葡萄球菌核酸酶（ＳＮａｓｅ）的类似物（ＳＮａｓｅＲ）及其不同点突变体的基因进行表达，经Ｂｉｏ－Ｒｅｘ７０柱层析及尿处理进行分离纯化，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上显示一条蛋白带，相对分子质量约为１７ｋＤ．测试了它们的比活力、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、Ｋｉ等酶动力学参数．结果表明，ＳＮａｓｅＲ与ＳＮａｓｅ的催化活性无显著差异，但ＳＮａｓｅＲ对底物的亲和力明显增加．３种点突变体对底物的亲和性都得到增强，其中ＳＮａｓｅＲ１１３为最．ＳＮａｓｅＲ１１３和ＳＮａｓｅＲ（１１３＋１４０）的催化活性增强，后者更为显著．

金黄色葡萄球菌核酸酶及其类似物盐酸胍变性的活力与构象变化的比较

金黄色葡萄球菌核酸酶（ＳｔａｐｈｌｏｃｏｃｃａｌＮｕｃｌｅａｓｅ，ＳＮａｓｅ）与其类似物（ＳＮａｓｅＲ）的平衡态盐酸胍变性与复性曲线及比活力值均无明显差别。两者变性与复性的构象变化是可逆的，但活力恢复滞后于失活。低浓度盐酸胍对ＳＮａｓｅＲ有２０％左右的激活，而低浓度（０．１２５ｍｏｌ／Ｌ）的ＮａＣｌ可使ＳＮａｓｅＲ的活力提高近一倍。ＳＮａｓｅＲ盐酸胍变性的失活先于构象变化。比较加入底物竞争抑制剂脱氧胸腺嘧啶核苷３＇－５＇－二磷酸（ｐｄＴｐ）后得到的（ＳＮａｓｅＲ＋ｐｄＴｐ＋Ｃａ２＋）三元络合物平衡态盐酸胍变性的Ｔｒｐ与Ｔｙｒ内源荧光的变化，观测到该酶的活性部位先于整体构象发生变化，结果导致ｐｄＴｐ解离常数Ｋｄ增大．

百里香酚对犊牛源生物被膜阳性金黄色葡萄球菌耐药性的消除作用

为了了解内蒙古地区犊牛病料中生物被膜阳性金黄色葡萄球菌的流行情况、耐药情况及百里香酚对生物被膜阳性金黄色葡萄球菌耐药性的消除作用。本试验采用生化鉴定和PCR方法,对采集到的104份犊牛病料进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定;采用K-B法检测了金黄色葡萄球菌分离株对18种抗菌药物的敏感性;采用改良结晶紫染色法测定分离株的生物被膜形成能力;选取2株生物被膜强阳性菌株,采用微量肉汤稀释法测定百里香酚对分离株的最小抑菌浓度,并进行百里香酚耐药性消除试验。结果显示,在104份犊牛病料中共分离鉴定获得43株金黄色葡萄球菌。药敏试验结果显示,金黄色葡萄球菌分离株对氨苄西林、头孢西丁、卡那霉素、复方新诺明和红霉素5种抗菌药物的耐药率达到50.0%以上;74.4%(32/43)的分离株为多重耐药株。生物被膜形成能力强、中、弱和无生物被膜形成能力的分离株分别占比23.3%(10/43)、16.3%(7/43)、32.6%(14/43)和27.9%(12/43);生物被膜阳性株中83.9%(26/31)为多重耐药株。百里香酚对2株生物被膜强阳性株的最小抑菌浓度均为256 mg/mL,经百里香酚处理后均恢复了对头孢噻肟的敏感性。结果表明,百里香酚对生物被膜阳性金黄色葡萄球菌具有一定的耐药消除作用。

核酸扩增信号放大技术在食源性金黄色葡萄球菌检测中的应用进展

基于核酸扩增的信号放大技术的蓬勃发展,引起了食源性致病菌检验检测技术的革新。如何构建可视化、低设备要求的快速检测方法并将其应用于实际检验,已经成为食品安全领域关注的焦点。功能化纳米材料以其优异的物理、化学性质及较高的生物亲和性成为搭载生物识别分子的优异信号平台。本文归纳总结了近5年来基于信号放大技术、纳米生物传感器技术在食源性金黄色葡萄球菌检测中的应用现状及研究进展,对不同方法的原理、应用范围、优势进行了综述,以期为食源性金黄色葡萄球菌检测方法的研发和应用提供新的思路。

金银花对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用研究

目的比较金银花对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)体外抑菌活性差异。方法收集30株MSSA和30株MRSA菌,使用头孢西丁筛选试验和mecA基因检测对菌株进行验证,使用琼脂打孔法检测金银花对两类金黄色葡萄球菌的抑菌活性并比较差异,使用琼脂稀释法检测金银花对两类金黄色葡萄球菌的MIC并计算出MIC_(50)。结果金银花对MSSA和MRSA均有体外抑菌活性且MIC_(50)均为3.125 mg/mL。结论金银花对MSSA和MRSA均有较好的体外抑菌活性,在临床治疗金黄色葡萄球菌感染方面有很大的应用前景。

基于RNA-seq鉴定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳房炎的关键应答基因

该研究旨在通过转录组测序技术发掘金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型奶牛乳房炎相关的关键应答基因,为发掘乳房炎防治有关的生物标志物奠定基础。于体外采用金黄色葡萄球菌处理MAC-T建立了金黄色葡萄球菌乳房炎细胞模型,并进行了转录组测序。同时从公共数据库中收集了9份金黄色葡萄球菌和大肠杆菌处理的乳腺上皮细胞转录组测序样本,结合生物信息分析技术进行了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳房炎关键应答基因的发掘。结果发现,乳腺上皮细胞中与金黄色葡萄球菌处理显著关联的差异表达基因有449个,其中上调差异基因有223个,下调差异基因有226个;另有347个差异表达基因与大肠杆菌处理显著关联,其中上调的差异表达基因116个,下调的差异表达基因有231个。功能富集分析发现,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳腺上皮细胞中的差异表达基因主要富集到IL-17信号通路。蛋白质互作分析发现,383个金黄色葡萄球菌型乳房炎特异性差异表达基因形成了21个调控网络,其中最大的调控网络包含了67个差异表达基因。另外,281个大肠杆菌乳房炎特异性差异表达基因形成了16个调控网络,其中最大的调控网络包含了33个差异表达基因。利用Cytoscap插件CytoHubba进一步筛选出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳房炎的关键应答基因各10个。这些关键应答基因的发掘将为进一步阐明金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳腺炎的发生发展作用机制奠定基础。

骨折内固定术后感染金黄色葡萄球菌患者的耐药监测及临床分析

目的 分析金黄色葡萄球菌在骨折内固定术后感染患者中的耐药情况。方法 回顾性分析四川省骨科医院2016年1月至2020年12月骨折内固定术后确诊为金黄色葡萄球菌感染的临床病例,共收集金黄色葡萄球菌467株。根据药物敏感性实验分为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)组(145株)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)组(322株),分析比较2组对常见抗菌药物的耐药情况。统计2016—2020年万古霉素对MRSA最低抑菌浓度(MIC)。结果 金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率达94.9%(443/467),对红霉素、克林霉素、苯唑西林、四环素耐药率较高,对左氧氟沙星、利福平、复方磺胺甲噁唑片、莫西沙星的耐药率较低[8.4%(39/467)、5.8%(27/467)、3.6%(17/467)、3.0%(14/467)],未发现对万古霉素、利奈唑胺、达托霉素耐药的菌株,万古霉素中介3株。MRSA组和MSSA组对克林霉素、苯唑西林、红霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素、利福平、复方磺胺甲噁唑片、四环素的耐药率比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。万古霉素对MRSA的MIC为2 mg/L的比例较高。结论 金黄色葡菌球菌引起的骨折内固定术后感染MRSA检出率较高,万古霉素MIC=2 mg/L的比例较高,降低了万古霉素治疗骨折内固定术后感染的达标率,且万古霉素骨组织渗透率不高,增加了临床治疗难度。因此万古霉素骨水泥植入,联合万古霉素静脉用药,或万古霉素静脉用药与利福平、喹诺酮类、磺胺类、利奈唑胺等联合用药可能是治疗骨折内固定术后感染的较好选择。

食源性金黄色葡萄球菌生物膜形成调控与生物防控策略研究进展

生物膜是很多食源性致病菌应对各种极端环境、杀菌理化因子以及维持菌体内环境稳定的重要基质屏障。数据显示,有超过80%的细菌感染由生物膜引起,尤以金黄色葡萄球菌感染多见。食源性金黄色葡萄球菌是引发细菌性食物中毒和食品安全事故的重要风险源,特别是多重耐药菌株。金黄色葡萄球菌的耐药性、致病性和免疫逃逸与生物膜复杂的三维结构有重大关系。由于生物膜结构基因和调控因子结构相对保守,现已成为金黄色葡萄球菌生物防控新的重要的效应靶点。本文从多糖细胞间黏附素、胞外DNA和生物膜形成相关蛋白等角度阐明了生物膜形成机制,从群体感应系统(如Agr系统和LuxS/AI-2群体感应系统)、全局性调控因子(如附属调节因子Sar和转录因子SigB)及双组分信号转导系统(如SrrAB系统、SaeRS系统、ArlRS系统、LytRS系统和WalKR系统)等角度系统阐述了生物膜形成调控机制。最后,从抗菌肽(蛋白)、植物源化合物、生物酶、抗菌药物等角度提出新的防控策略,以期为食源性金黄色葡萄球菌的生物防控提供指导。

生牛乳中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌全基因组序列分析

目的了解生牛乳中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的全基因组序列特征,分析其耐药基因和毒力基因的分子特征差异。方法采用全自动微生物鉴定药敏分析仪进行细菌鉴定;通过肉汤微量稀释法进行药物敏感性检测;利用生物信息学工具对全基因组测序结果进行分子特征分析。结果SJ23319菌株和SJ23506菌株经鉴定均为MRSA;SJ23319菌株耐药谱为OXA-PEN-FOX,SJ23506菌株耐药谱为OXA-PEN-FOX-CC,耐药基因分析结果显示两个菌株均携带耐药基因mecA和blaZ,这与耐药表型结果基本一致;2个菌株染色体基因组大小、结构和功能蛋白相似,SJ23319菌株为ST59-t437-SCCmecIVa型,SJ23506菌株为ST398-t034-SCCmecV(5C)型;2个菌株功能蛋白均分布于21个直系同源簇(cluster of orthologous group,COG)条目中,携带13种相同的耐药基因,SJ23319菌株还携带有四环素类耐药基因tet(K);2个菌株携带毒力基因多达67种,SJ23319菌株携带更多的细菌黏附相关基因(fnbA/B、sdrD/E)和外毒素基因(Seb、Selk、Selq、set16-26)。结论SJ23319(ST59)菌株比SJ23506(ST398)菌株携带更多的耐药基因和毒力基因,致病性更强,进一步证明在牲畜相关的MRSA(livestock-associated MRSA,LA-MRSA)菌株中,ST59型比ST398型更容易导致社区流行和感染,应当在MRSA流行监测中更加重视。

荧光探针法金黄色葡萄球菌核酸检测方法的建立

基于荧光探针法建立一种快速、灵敏的金黄色葡萄球菌核酸检测方法。针对金黄色葡萄球菌nuc基因设计特异性引物和探针,制备质粒标准品和菌液核酸标准品,完成方法建立。然后,对该方法的特异性、敏感性、重复性、实用性等性能进行评价。结果显示,该方法特异性100%;质粒标准品敏感性为1 copy/μL;菌液标准品敏感性为1000 CFU/mL;重复性变异系数为0.69%;多种基质加标样品均能有效检出。成功建立了一种快速、灵敏的金黄色葡萄球菌核酸检测方法,可用于疑似金黄色葡萄球菌污染样品的快速核酸检测。

外周血指标对鼻息肉患者黏膜中IL-5和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E阳性表达的预测价值

目的借助外周血指标预测慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)2型生物标志物。方法收集2020年6月~2022年5月在北京同仁医院鼻科住院的CRSwNP患者临床资料,检测外周血中嗜酸粒细胞百分比(Eos%)、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE以及CRSwNP黏膜中白细胞介素5(IL-5)和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E(Staphylococcus aureus enterotoxinimmunoglobulin E,SE-IgE)。应用受试者工作特征(ROC)曲线评估每个外周血指标对黏膜IL-5/SE-IgE阳性表达预测价值,利用Logistic回归筛选对黏膜IL-5/SE-IgE阳性有预测价值的外周血指标,构建诺模图模型。结果CRSwNP患者哮喘比例、血中Eos%、骨膜蛋白和总IgE在IL-5/SE-IgE阳性和阴性两组之间,均具有统计学差异。ROC曲线单因素分析显示血Eos%、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE对黏膜IL-5和SE-IgE阳性预测的AUC分别波动在0.655~0.784和0.721~0.802,Logistic回归确认血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE可分别作为IL-5和SE-IgE阳性的独立预测因素。构建预测CRSwNP黏膜IL-5/SE-IgE阳性的诺模图模型,一致性指数(C-index)为0.804和0.81,提示具有很好的预测准确性。结论血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE分别构建的诺模图,对CRSwNP黏膜IL-5和SE-IgE阳性表达具有很好的预测价值,可以预判CRSwNP内型和表型严重性。

一起金黄色葡萄球菌引起的学校食物中毒的流行病学调查与实验室分析

目的对一起学校食物中毒事件发生的原因和可疑危险因素进行流行病学调查与实验室分析,提出有效防控措施。方法利用现场流行病学与卫生学调查,了解患病情况及可疑食物;采集可疑食品、外环境和病例的标本进行荧光定量PCR检测、金黄色葡萄球菌分离与鉴定、药物敏感性分析、全基因组测序。结果共11名患者,其临床症状主要是恶心、腹痛(100%),其次为呕吐(81.82%);可疑食物为某饼家生产的“脆皮法棍泡芙”,致病因素为金黄色葡萄球菌A型肠毒素,来源于食品泡芙样本的金黄色葡萄球菌和来源于患者肛拭子样本的金黄色葡萄球菌具有同源性,所检出的金黄色葡萄球菌均对青霉素耐药(耐药率100%)。结论本次食物中毒事件是由某饼家从业人员携带金黄色葡萄球菌,在制作“法棍泡芙”过程中污染食物而引起的金黄色葡萄球菌A型肠毒素中毒。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致新生儿坏死性筋膜炎1例

本研究报道1例以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染致右背部皮肤红肿、局部呈黑紫色坏死起病的新生儿,诊断为MRSA新生儿坏死性筋膜炎(NF),同时合并脓毒血症、感染性休克。经早期呼吸循环支持、切开引流、抗感染、外科清创并负压封闭引流(Vacuum sealing drainage,VSD)联合邮票状皮片移植技术治疗后,患儿病情好转出院。本研究旨在为MRSA致新生儿NF的早期诊治提供策略,同时推广邮票状皮片移植技术在新生儿NF中的应用,提高新生儿存活率。

奶牛金黄色葡萄球菌性乳房炎诊治

金黄色葡萄球菌(SA)简称金葡菌,是引起奶牛乳房炎的主要致病菌。金葡菌引起的奶牛乳房炎具有病程长、传播速度快、反复发作、治愈率低等特点,可对产奶腺体组织造成不可逆的损伤,导致奶牛生产性能和奶质显著下降。