基于荧光生物传感技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的利用纳米金粒子(gold nanoparticles,AuNPs)荧光猝灭性能和核酸适配体的高亲和力,构建一种简便、灵敏的纳米金“Turn-on”型荧光生物传感方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxins B,SEB)的方法。方法以AuNPs作为荧光体的能量受体(猝灭剂),荧光素-单链DNA(fluorescein-ssDNA,FAM-ssDNA)作为荧光能量供体,冷冻法制备AuNPs-SEB适配体复合物,基于AuNPsSEB适配体复合物/SEB/FAM-ssDNA的竞争性结合,构建纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测方法。对缓冲体系pH和反应时间等条件进行优化,以牛奶为代表对方法检测性能进行验证。结果在优化好的实验条件(pH 7.5、反应时间15 min和反应温度25℃)下,在10^(-1)~10^(4)ng/mL范围内,荧光强度与SEB质量浓度之间呈现良好的线性关系,其相关系数为0.995,检出限为0.062 ng/mL。应用于牛奶样品中SEB的测定,方法回收率为91.2%~108.0%,相对标准偏差在2.6%~5.2%范围之间。结论该纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测技术具有简便、灵敏和准确等优点,可为食品中污染物的检测提供一种可行的新方法。

基于裁剪适配体的纳米金比色法用于金黄色葡萄球菌肠毒素A的可视化检测

目的:筛选适配体作为分子识别原件,基于纳米金的盐效应构建生物传感器,实现金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)的快速定量检测。方法:采用分子对接和分子动力学模拟对SEA适配体进行截短指导和结果预测,利用纳米金显色法验证模拟结果,对SEA适配体优化并将其作为分子识别原件,优化反应体系,探讨SEA质量浓度与吸光度比值间的关系,构建一种可视化的SEA快速检测分析方法,并对方法的准确度、精密度和特异性进行评价。结果:筛选出一条序列短、亲和力高、特异性强且稳定的SEA适配体,建立了一种基于纳米金比色的SEA可视化检测方法,检出限低,加标回收结果满意。结论:采用分子模拟能有效提高适配体筛选效率,本方法可用于SEA快速检测。

牛奶模拟样本中金黄色葡萄球菌肠毒素C含量的两种发光检测方法比较

目的 比较均相光激化学发光检测法(AlphaLISA)和磁微粒化学发光检测法(MP-CLIA)在检测牛奶模拟样本中金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)含量的敏感性和精确性。方法 以山羊抗SEC多克隆抗体偶联受体微球、生物素标记的SEC单克隆抗体和链霉亲和素偶联的供体微球,构建AlphaLISA检测体系;以山羊抗SEC多克隆抗体偶联碱性磷酸酶、生物素标记的SEC单克隆抗体和链霉亲和素偶联磁珠,构建MP-CLIA检测体系。结果 AlphaLISA检测牛奶模拟样本中SEC含量的灵敏度为4.04 ng/L,变异系数(CV)为1.98%~9.82%;MP-CLIA的灵敏度为108.19 ng/L,CV为4.63%~20.40%。结论 与MP-CLIA相比,AlphaLISA检测牛奶模拟样本中SEC含量的敏感性和精确性更高。

一起餐馆疑似金黄色葡萄球菌肠毒素所致食源性疾病事件调查

目的:分析并查明一起由金黄色葡萄球菌肠毒素导致的餐馆食源性疾病事件,以期预防此类食品安全事件的发生,为临床治疗提供依据。方法:采用现场流行病学调查方法中的描述性研究方法,按照《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》(GB 4789.10—2016)进行检验,同时检测葡萄球菌肠毒素。结果:此次事件疑似为一起由金黄色葡萄球菌肠毒素污染不明食品引起4人出现腹泻、呕吐等症状的事件。结论:应加强餐饮行业人员卫生培训,餐馆卫生监督管理,避免该类事件再次发生,以保障食品安全。

金黄色葡萄球菌肠毒素在食源性微生物中的研究进展

由细菌污染引起的食源性疾病依然是影响人类公共健康和食品安全的最大问题之一。其中,金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌,引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性球菌,广泛分布于自然界,是引起化脓性疾病的重要病原菌,也是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌。食品受金黄色葡萄球菌污染后,不仅会腐败变质,而且部分菌株产生金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)而引起食物中毒,由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的首位。所以,对SEs的研究以及快速、精确的检测和筛查,成为关键环节。本文拟对金黄色葡萄球菌肠毒素生物学性状、致病性、检验方法等方面的研究进展进行综述。当然,对金黄色葡萄球菌及其主要致病因子肠毒素的研究有待进一步深入与发展。

金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分型和分布

目的:建立金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测方法。初步研究生牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布状况。方法:应用PCR扩增经分离鉴定的金黄色葡萄球菌肠毒素基因SEA-SEJ,电泳检测扩增结果。结果:建立了金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR检测方法。从生牛奶中分离的29株金黄色葡萄球菌检测到SEA-SED和SEG-SEJ基因,没有检测到SEE基因。毒素基因携带率为65.5%,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占37.9%。有SEA基因的占51.7%,含其它传统的毒素基因类型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占17.2%,携带新发现的毒素基因SEG、SEH、SEI和SEJ的菌株占41.4%。结论:建立的PCR检测金黄色葡萄球菌的肠毒素基因的方法可用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型和分布的研究。研究表明,生牛奶中分离的金黄色葡萄球菌带毒率高,而且携带新发现的肠毒素基因的较多。

金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的免疫治疗策略

金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的一类具有呕吐活性的细菌外毒素,可引起严重的炎症反应和食物中毒。SEs具有超抗原活性,可与T细胞受体的可变区和MHC Ⅱ类分子形成三元复合物(TCR-SEs-MHC Ⅱ),直接刺激T淋巴细胞大量产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-2、IL-6和γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)等细胞因子,从而导致中毒性休克综合征(toxicshocksyndrome,TSS)。在临床常见的SEs中,肠毒素A(staphylococcalenterotoxin A,SEA)和肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)是出现频率最高、毒性最大、危害最严重的两种。目前尚没有针对SEs中毒治疗策略的综述性研究。本文首先概述了SEs的分类、结构及毒性作用,重点围绕SEA和SEB,分析了TCR-SEs-MHC II类分子相互作用位点,最后总结了针对SEs中毒的主动免疫疗法和被动免疫疗法,本文为SEs的深入研究提供了必要信息。

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定

目的构建含SEA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,插入到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达及鉴定。结果PCR扩增约770bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与文献报道结果一致,表达蛋白相对分子质量约31000,纯化后鉴定为SEA蛋白。结论已成功获得SEA蛋白,为其进一步研究和应用奠定基础。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达

目的克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrapTMchelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。

金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因克隆、表达及活性试验

利用PCR从金黄色葡萄球菌标准株 (Staphylococcusaureus,ATCC13 5 65 )中克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的基因 ,序列测定结果与报道完全一致。构建了表达载体pET SEA并获得高效表达 ,重组蛋白 (rSEA)在 3 7℃诱导时以包涵体形式存在 ,降低温度则出现可溶表达 ,可溶性rSEA占总rSEA的 5 5 %。可溶性rSEA经Ni2 + 亲和层析纯化 ,达电泳纯。通过同源模建对rSEA对SEA进行结构比较 ,结果表明尽管rSEA比野生型SEA多了 9个氨基酸但其结构并没有明显的变化。单核细胞增殖试验进一步证明了该结论 :将rSEA与SEA同外周血单个核细胞共同培养 ,两者均能有效地促进其增殖。将rSEA与体内激活的脾细胞共培养 。

食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测方法

采用反向被动乳胶凝集法 (RPLA)和mini VIDAS (ELFA)两种方法对 42份金黄色葡萄球菌阳性样品进行了肠毒素检测。结果RPLA法的金葡菌肠毒素检出率为 61 9% (P<0 0 5 )要高于ELFA法的检出率 5 0 0 % (P <0 0 5 ) ,但检测时间长 ( 2 0h)。在实验中我们还发现 ,血浆凝固酶阴性的葡萄球菌也可产生肠毒素 ,其原因有待进一步的研究。

乳品中金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫传感检测方法的研究

本文利用自制的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)抗体构建了一种L-半胱氨酸和纳米金的双层自组装免疫传感器,采用循环伏安法及交流阻抗法对传感器进行表征与测定,并对各项相关条件进行优化,最终建立了SEB检测的标准曲线,线性范围分别在2～10 ng/mL和10～100 ng/mL,相关系数分别为0.9939和0.9926,检出限(S/N=3)为0.667 ng/mL,乳品检测回收率在84.3%～93.2%之间。该传感器特异性良好,稳定性好,可再生使用,可应用于乳品中SEB的快速检测。

金黄色葡萄球菌肠毒素B对豚鼠哮喘模型Th1/Th2细胞因子的影响

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)对豚鼠支气管哮喘(简称哮喘)模型气道炎症及Th1/Th2细胞因子的影响。方法27只豚鼠随机分为对照组,模型组,SEB组各9只,用卵白蛋白(OVA)建立哮喘模型。末次激发豚鼠24-48 h内处理,支气管肺泡灌洗,直接记数总白细胞和嗜酸性粒细胞,观察肺组织病理改变,分装冻存支气管肺泡灌洗液做细胞因子检测。结果SEB组豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量为(2.6±0.64)×106,显著低于模型组的(13.0±1.8)×106(P<0.01);肺组织哮喘炎症反应也轻于模型组;SEB组肺泡灌洗液中Th1细胞因子IFNγ-浓度(126.41±5.17)pg/mL,高于模型组(86.52±5.10)pg/mL(P<0.05);而Th2细胞因子IL-4浓度(50.02±2.79)pg/mL低于模型组(78.30±3.88)pg/mL(P<0.05)。结论SEB能减少哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量,可以通过调节Th1/Th2细胞因子的比值来减轻气道哮喘炎症反应。

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的:金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一,针对进出口食品卫生监测的需要,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法:利用聚合酶链反应技术(PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对,来判断阴阳性结果。结果:本方法检出率高,每克样品中有有4个金黄色葡萄球菌即可检出, 24h即可报告结果。结论:PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确,检测周期短,既可提高检出率,又可节省检测时间。

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用

目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼接并与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 :成功扩增出 h PLAP- 1C末端信号肽序列 131bp和 SEA基因序列 796 bp;经测序证实 ,二段基因序列成功拼接 (90 1bp)。结论 :重叠区扩增基因拼接法能将 SEA基因与 h PL AP- 1C末端信号肽序列拼接 ,形成融合基因。

金黄色葡萄球菌肠毒素

金黄色葡萄球菌是一种重要的病原体,它产生多种类型的毒素,从而引起各种类型的疾病。金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs),是一组血清学上互不相同的热稳定肠毒素,有10个血清型。由于食入了被SEs污染的食品而主要引起肠胃炎,此外,SEs还是一种强的超抗原,它可以刺激非特异性T细胞增殖。SEs各型之间有着相似的结构和功能。

利用表面等离子体谐振技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素B

本文研究了利用自行研制开发的表面等离子体谐振 (SPR - 2 0 0 0 )生化分析仪检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)与其羊单克隆抗体IgG的免疫吸附反应 ,并研究了用SPR技术检测生物大分子相互识别反应相关的一些问题。为了消除溶液间本体折射率差异的影响 ,我们采用牛血清白蛋白 (BSA)本体折射率补偿法 ,使通入流动系统的不同溶液获得基本一样的本体折射率 ,获得了很好的效果。在此基础上 ,SPR - 2 0 0 0生化分析仪初步实验已经能检测到的SEB最低浓度是 1μg/ml,相当于 3 5× 10 -8M。进一步的实验仍在进行中。

金黄色葡萄球菌肠毒素B对小鼠淋巴细胞产生肿瘤坏死因子-α的影响

目的 观察金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对淋巴细胞产生肿瘤坏死因子 (TNF)-α的影响。方法 密度梯度离心法获得鼠脾淋巴细胞 ,不同时间和浓度的SEB处理 ,流式细胞仪检测产生TNF -α的淋巴细胞阳性率。结果 TNF -α的产生在 5d和 10 0ng·ml-1时达到高峰。结论 SEB能有效刺激淋巴细胞产生TNF -α。