基于荧光生物传感技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的利用纳米金粒子(gold nanoparticles,AuNPs)荧光猝灭性能和核酸适配体的高亲和力,构建一种简便、灵敏的纳米金“Turn-on”型荧光生物传感方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxins B,SEB)的方法。方法以AuNPs作为荧光体的能量受体(猝灭剂),荧光素-单链DNA(fluorescein-ssDNA,FAM-ssDNA)作为荧光能量供体,冷冻法制备AuNPs-SEB适配体复合物,基于AuNPsSEB适配体复合物/SEB/FAM-ssDNA的竞争性结合,构建纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测方法。对缓冲体系pH和反应时间等条件进行优化,以牛奶为代表对方法检测性能进行验证。结果在优化好的实验条件(pH 7.5、反应时间15 min和反应温度25℃)下,在10^(-1)~10^(4)ng/mL范围内,荧光强度与SEB质量浓度之间呈现良好的线性关系,其相关系数为0.995,检出限为0.062 ng/mL。应用于牛奶样品中SEB的测定,方法回收率为91.2%~108.0%,相对标准偏差在2.6%~5.2%范围之间。结论该纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测技术具有简便、灵敏和准确等优点,可为食品中污染物的检测提供一种可行的新方法。

回毒银花散中各药及药物不同配比对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的作用研究

目的研究《外科正宗》中回毒银花散对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin⁃resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的抑菌能力以及毒力因子α-溶血素(α⁃hemolysin,Hla)活性和生物被膜形成的抑制作用,同时探究回毒银花散最佳配比为古方新用提供实验支撑。方法通过最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)、纸片扩散法(K⁃B法)分析回毒银花散及组方中各味药对MRSA菌株USA300的抑制效果,溶血实验、Hla中和实验、Hla寡聚实验、免疫印记(Western blot)实验验证药物以何种形式抑制毒力因子Hla的活性,生物被膜形成实验评价回毒银花散对生物被膜的抑制效果,最后正交实验探究回毒银花散的最佳配比。结果回毒银花散抑制MRSA菌株,MIC_(90)为64 mg/mL,MBC为256 mg/mL,抑菌圈直径为(7.50±0.50)mm。回毒银花散还通过抑制Hla的释放抑制Hla的活性,最小有效浓度(minimum effective concentration,MEC)为16 mg/mL,抑制生物被膜形成的MEC为8 mg/mL。回毒银花散中金银花、黄芪只影响MRSA溶血活性以及生物被膜形成但不抑制细菌的生长,两药溶血活性MEC以及生物被膜形成MEC均为32 mg/mL;甘草抑菌能力较强,MIC_(90)为8 mg/mL,生物被膜MEC为1 mg/mL,在亚抑菌浓度下未表现出抑制溶血活性。最后正交实验显示,当回毒银花散中金银花、黄芪、甘草比例为1∶2∶4时,MIC_(90)为16 mg/mL,溶血活性MEC为8 mg/mL,生物膜形成MEC为4 mg/mL,均为9组中最低。结论回毒银花散在亚抑菌浓度下可影响MRSA的溶血活性以及生物被膜形成,其中金银花、黄芪、甘草的最佳比例为1∶2∶4。

新疆驼乳源金黄色葡萄球菌MLST分型与毒力基因检测

为了解驼乳源金黄色葡萄球菌多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)与毒力基因携带情况,本试验对新疆驼乳源分离得到的金黄色葡萄球菌进行MLST、药物敏感性检测、生物被膜形成能力和溶血性检测以及毒力基因检测。结果表明,金黄色葡萄球菌在健康生驼乳中的分离率为5%(4/80);4株金黄色葡萄球菌分别属于ST8114、ST8119、ST2073和ST130(其中ST8114和ST8119为新的序列型),对12种抗菌药物全部敏感;在4株驼乳源金黄色葡萄球菌中可检测到sei、hla、hlb、clfA和clfB等毒力基因,并且均具有生物被膜形成能力和溶血活性。说明新疆驼乳源金黄色葡萄球菌分型丰富,在宿主致病和食品生产安全等方面存在隐患。本研究可为新疆驼乳源金黄色葡萄球菌的相关研究提供基础试验数据。

内蒙古地区犊牛源金黄色葡萄球菌的耐药性分析及毒力基因检测

为了了解内蒙古地区犊牛源金黄色葡萄球菌的耐药表型、耐药基因及毒力基因的流行情况,试验对采集的104份犊牛病料(鼻拭子37份、口腔拭子13份、粪便样本54份)进行犊牛源金黄色葡萄球菌的分离纯化、生化鉴定及分子生物学鉴定,并对分离的犊牛源金黄色葡萄球菌菌株进行药敏试验、耐药基因及毒力基因检测。结果表明:通过对犊牛病料进行分离培养及生化鉴定,得到43株革兰氏阳性球菌,初步判定分离菌为犊牛源金黄色葡萄球菌,分离率为41.3%。43株分离株16S rDNA基因PCR扩增得到1 505 bp大小的目的条带,与预期结果相符。分离株对氨苄西林、头孢西丁、复方新诺明、卡那霉素等药物耐药,耐药率分别为100%、90.7%、81.4%、60.5%;对环丙沙星的耐药率最低,耐药率为9.3%。耐药基因中blaZ基因的检出率最高,为90.7%;norA与norB基因检出率相同,均为81.4%;ermA基因检出率为30.2%;ermB基因检出率为39.5%;emrC基因检出率为14.0%;Sul1基因检出率为53.5%;同时携带7种耐药基因的检出率为4.7%。毒力基因中hla基因的检出率最高,为58.1%;hlb基因检出率为27.9%;pvl基因检出率为18.6%;其余毒力基因未被检出。说明内蒙古地区犊牛源金黄色葡萄球菌耐药性比较严重,携带多重耐药基因,并携带hla、hlb、pvl毒力基因,建议临床上根据药敏试验结果科学合理地选择抗菌药物,有效做好疫病防控。

一株分离于生鲜乳的金黄色葡萄球菌毒力与耐药性分析

为了解生鲜乳中金黄色葡萄球菌的特性,试验通过无菌采集新疆某规模化牛场混合新鲜乳样,采用常规分离方法结合PCR方法检测特异性nuc基因分离鉴定金黄色葡萄球菌,分析分离菌株对7类11种抗生素的耐药表型,采用PCR方法对金黄色葡萄球菌常见重要的8种毒力基因和6种耐药基因进行检测并分析其致病性。结果表明新鲜乳样中分离到一株金黄色葡萄球菌;该菌对青霉素、氨苄西林耐药,对卡那霉素、四环素4种抗生素处于中介,对庆大霉素、红霉素、头孢唑林等5种抗生素敏感;携带sec、sea、hla、tsst-1、pvl、clf A 6种毒力基因和qac A、msr A、erm C、mec A 4种耐药基因;能引起感染小鼠明显的组织病理变化并导致死亡。说明分离于生鲜乳中的金黄色葡萄球菌携带众多毒力基因和耐药基因,具有广泛的多重耐药性。

金黄色葡萄球菌毒力和耐药基因分布与耐药相关性分析

目的 明确临床分离的金黄色葡萄球菌(SA)中毒力和耐药基因的分布及其与临床常用抗菌药物耐药性的关系。方法收集2016年1月至2022年2月非重复分离自分泌物、血液临床标本中的158株SA,采用Vitek2 Compact或Phoenix 100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药敏分析。PCR筛查SA毒力基因(hla、nuc、coa、pvl、sea、seb、eta、etb、tst)和耐药基因(mecA、mecC、aac(A)-aph(D)、aph(3’)-IIIa),并分析其与临床常用抗菌药物耐药性之间的关系。结果 临床科室中检出SA较多的是普通骨科(67/158,42.4%)和普通外科(29/158,18.4%)。158株SA均携带hla和nuc。59株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中毒力基因seb检出率高于甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA),而MSSA中毒力基因coa检出率高于MRSA(P<0.05)。coa+菌株对苯唑青霉素的耐药率低于coa-菌株,环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺甲恶唑的耐药率高于coa-菌株;pvl+菌株对红霉素、克林霉素的耐药率高于pvl-的菌株;sea+菌株对环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率高于sea-菌株;seb+菌株对苯唑青霉素的耐药率高于seb-的菌株(P<0.05)。aph(3’)-IIIa+菌株对苯唑青霉素、红霉素、克林霉素、四环素的耐药率高于aph(3’)-IIIa-菌株;aac(A)-aph(D)+菌株对环丙沙星、红霉素、利福平、庆大霉素、左氧氟沙星、克林霉素、四环素、复方磺胺甲恶唑的耐药率高于aac(A)-aph(D)-菌株(P<0.05)。结论 临床分离金黄色葡萄球菌中MRSA检出率较高,毒力基因及氨基糖苷类耐药基因携带与细菌的耐药性相关,临床应合理用药并加强监测,以减缓和控制耐药金黄色葡萄球菌尤其是MRSA的播散。

新疆阿克苏地区羊源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离鉴定及毒力基因与耐药性分析

近年来在家畜体内及动物性食品中多次检测到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),该菌对人和动物健康造成严重威胁。为了解新疆阿克苏地区患呼吸道疾病羊携带的病原菌,本研究从阿克苏6个规模化羊场共采集280份(136份病羊和144份健康羊)鼻拭子样品,分别划线接种于BHI脱纤维绵羊血平板和高盐甘露醇琼脂平板,并对分离菌经革兰氏染色镜检和生化鉴定。结果显示,初步从136份病羊和144份健康羊鼻拭子样品中分别分离到34株及62株共计96株金黄色葡萄球菌(SA)。通过PCR分别扩增SA的nuc基因及MRSA的mecA基因,结果进一步显示分离到96株SA,其中24株(25%)为MRSA,且均为从患病羊中分离。通过PCR检测MRSA的6种常见毒力基因。结果显示,24株MRSA中clfa、hla及pvl的检出率均为100.0%,tst、fnb B和sec的检出率分别为41.2%(10/24)、45.7%(11/24)和33.6%(8/24)。将24株MRSA分别以10^(4)cfu/mL~10^(8)cfu/mL感染小鼠,通过观察各组小鼠的临床症状统计死亡率,观察死亡小鼠脏器的剖检病变,并再次从组织中分离细菌,以评估分离的MRSA对小鼠的致病性。结果显示,感染8 h后各组小鼠开始出现临床症状,10^(8)cfu/mL和10^(7)cfu/mL感染组小鼠在感染后不同时间全部死亡;10^(6)cfu/mL~10^(4)cfu/mL感染组小鼠的死亡率分别为83.3%、83.3%及33.3%;对照组小鼠72 h内全部健活。剖检可见死亡小鼠肺脏表面大面积出血,肝脏、脾脏肿大,其余脏器未见明显变化,可从死亡小鼠的肺脏中再次分离到MRSA。最终确定22株MRSA对小鼠具有致病性。采用K-B纸片法检测24株MRSA对9类15种药物的敏感性,采用PCR检测24株MRSA的耐药基因mecC、blaZ(β-内酰胺类)、ermA(大环内酯类)、Aac(6')/aph(2'')、aph(3')-Ⅲ、Ant(4')-Ia(氨基糖苷类)、qnr A(喹诺酮类)和tetM(四环素类)。药敏试验结果显示,24株MRSA对β-内酰胺类的青霉素及氨曲南,头孢菌素类的氨苄西林全部耐药,其中14株MRSA为多重耐药(58.3%,14/24),主要以3重耐药菌株为主,占42.8%(6/14),其次分别为4重耐药(28.6%,4/14)、5重耐药和6重耐药(均为14.3%,2/14)的菌株。但也有部分菌株对四环素、红霉素、克林霉素和环丙沙星敏感。耐药基因检测结果显示,24株MRSA中检测到6种耐药基因,其中mecC、blaZ的检出率达100%;tetM的检出率为79.2%(19/24);ermA的检出率为37.5%(9/24);Aac(6')/aph(2'')、aph(3')-Ⅲ、Ant(4')-Ia的检出率均为25.0%(6/24),且这些MRSA携带3~6种耐药基因。通过实验结果分析24株MRSA的耐药表型与耐药基因之间均呈正相关,且未检测到喹诺酮类耐药基因qnr A,与MRSA对该类药物环丙沙星敏感的结果也一致。本研究在新疆阿克苏地区患呼吸道疾病的羊中分离的MRSA携带多种毒力基因,对小鼠的致病性均较强,且对多种药物耐药并携带多种耐药基因,可能与羊患呼吸道疾病有关。本研究为新疆阿克苏地区羊呼吸道疾病病原学的研究和临床用药提供参考。

基于深度学习构建金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的快速图像识别系统

目的基于GoogleNet、ResNet101和Vgg193种深度学习模型,对血流感染病原菌(金黄色葡萄球菌、粪肠球菌)进行高置信度的识别,比较模型间的性能与分类能力,探讨深度学习模型对血流感染病原菌快速识别的应用可行性。方法将革兰染色及摄像预处理后的细菌图像和空白对照图像输入模型,进行训练与验证,共采集1682张金黄色葡萄球菌、1723张粪肠球菌和688张空白对照显微图像,对其中1344张金黄色葡萄球菌、1376张粪肠球菌和544张空白对照图像进行训练,余下的图像用于验证。根据模型间的分类参数评估出性能最佳的模型。结果ResNet101模型识别三类验证集图像的交叉熵损失值(0.0087103)最低,Epoch值(93)最大且准确率(99%)最高;GoogleNet模型识别三类验证集图像的交叉熵损失值为0.06389,Epoch值为86,准确率为98.6%;Vgg19模型识别三类验证集图像的交叉熵损失值为0.035682,Epoch值为86,准确率为97.7%。结论ResNet101模型在对三类验证集图像的分类上性能最佳;深度学习模型可对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的革兰染色图像进行准确、可信的快速识别。

抗IL-20单抗7E在金黄色葡萄球菌肺炎小鼠中的抗炎和肺保护作用

目的研究抗IL-20单抗在金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,SA)肺炎中的作用。方法小鼠随机分为对照组、模型组、抗IL-20单抗7E干预组(7E)和万古霉素阳性对照组(Vanc)。通过气管滴注法建立小鼠SA肺炎小鼠模型,干预组在造模后通过尾静脉注射给药。收集外周血,并对外周血中白细胞和中性粒细胞计数,ELISA法检测血清中CRP、IL-20、TNF-α、IL-6和IL-1β水平;HE染色观察肺组织病理形态变化(包括肺泡结构完整性、肺泡间隔厚度、炎症、坏死及炎性细胞浸润情况),免疫组织化学和Westernblot检测小鼠肺组织中TLR2、NF-κBp65、p-STAT3的表达。结果与对照组比较,模型组肺发生明显病理改变,而7E组和Vanc组肺组织病理形态明显改善,治疗第3天开始肺泡恢复,无明显炎性细胞浸润。治疗后第4 d,7E组和Vanc组外周血中白细胞和中性粒细胞计数、血清中IL-20、TNF-α、IL-6和IL-1β含量以及肺组织中TLR2、NF-κBp65、p-STAT3的表达均明显降低。结论抗IL-20单抗7E可能通过抗炎作用延缓SA的进展,其机制可能与抑制STAT3以及TLR2/NF-κB通路有关。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的培养产毒与柱层析纯化

本文采用玻璃纸覆盖琼脂平板法,在37℃培养金黄色葡萄球菌48h后,收集菌体,10000×g离心15min,上清液经聚乙二醇20000浓缩。浓缩液依次经羧甲基阳离子交换纤维素CM-32层析和葡聚糖凝胶SephadexG-75过滤纯化,获得电泳纯的金黄色葡萄球菌B型肠毒素。实验证明,利用该简化的二步柱层析分离得到的金黄色葡萄球菌B型肠毒素完全能满足血清学检实验和鉴定的要求,方法简便易行,一般实验室均可使用。

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约 70 0bp的DNA片段 ,将之克隆到pGEM 7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因 ,它含有 717bp(不包括N端81bp的信号肽编码区 ) ,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体 7ZTS上 ,转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)内。表达的SEB占总蛋白 33.5 %。

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的 :金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一 ,针对进出口食品卫生监测的需要 ,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法 :利用聚合酶链反应技术 (PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交 ,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对 ,来判断阴阳性结果。结果 :本方法检出率高 ,每克样品中有 4个金黄色葡萄球菌即可检出 ,2 4小时即可报告结果。结论 :PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确 ,检测周期短 ,既可提高检出率 ,又可节省检测时间。

金黄色葡萄球菌肠毒素B对豚鼠哮喘模型Th1/Th2细胞因子的影响

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)对豚鼠支气管哮喘(简称哮喘)模型气道炎症及Th1/Th2细胞因子的影响。方法27只豚鼠随机分为对照组,模型组,SEB组各9只,用卵白蛋白(OVA)建立哮喘模型。末次激发豚鼠24-48 h内处理,支气管肺泡灌洗,直接记数总白细胞和嗜酸性粒细胞,观察肺组织病理改变,分装冻存支气管肺泡灌洗液做细胞因子检测。结果SEB组豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量为(2.6±0.64)×106,显著低于模型组的(13.0±1.8)×106(P<0.01);肺组织哮喘炎症反应也轻于模型组;SEB组肺泡灌洗液中Th1细胞因子IFNγ-浓度(126.41±5.17)pg/mL,高于模型组(86.52±5.10)pg/mL(P<0.05);而Th2细胞因子IL-4浓度(50.02±2.79)pg/mL低于模型组(78.30±3.88)pg/mL(P<0.05)。结论SEB能减少哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量,可以通过调节Th1/Th2细胞因子的比值来减轻气道哮喘炎症反应。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达

目的克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrapTMchelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。

乳品中金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫传感检测方法的研究

本文利用自制的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)抗体构建了一种L-半胱氨酸和纳米金的双层自组装免疫传感器,采用循环伏安法及交流阻抗法对传感器进行表征与测定,并对各项相关条件进行优化,最终建立了SEB检测的标准曲线,线性范围分别在2～10 ng/mL和10～100 ng/mL,相关系数分别为0.9939和0.9926,检出限(S/N=3)为0.667 ng/mL,乳品检测回收率在84.3%～93.2%之间。该传感器特异性良好,稳定性好,可再生使用,可应用于乳品中SEB的快速检测。

金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究

目的 :探讨金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )L型肠毒素B的产生量及其基因存在情况。方法 :将金葡菌诱导成稳定L型后 ,用ELISA法检测葡萄球菌肠毒素B(SEB) ,用PCR法检测SEB基因。结果 :金葡菌L型SEB的产生量与原菌比差别无显著性 (P >0 .0 5 ) ,PCR发现 4 78bp的阳性条带。结论 :金葡菌变异为L型后SEB产生量不变 ,其基因也未丢失。

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的:金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一,针对进出口食品卫生监测的需要,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法:利用聚合酶链反应技术(PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对,来判断阴阳性结果。结果:本方法检出率高,每克样品中有有4个金黄色葡萄球菌即可检出, 24h即可报告结果。结论:PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确,检测周期短,既可提高检出率,又可节省检测时间。

利用表面等离子体谐振技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素B

本文研究了利用自行研制开发的表面等离子体谐振 (SPR - 2 0 0 0 )生化分析仪检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)与其羊单克隆抗体IgG的免疫吸附反应 ,并研究了用SPR技术检测生物大分子相互识别反应相关的一些问题。为了消除溶液间本体折射率差异的影响 ,我们采用牛血清白蛋白 (BSA)本体折射率补偿法 ,使通入流动系统的不同溶液获得基本一样的本体折射率 ,获得了很好的效果。在此基础上 ,SPR - 2 0 0 0生化分析仪初步实验已经能检测到的SEB最低浓度是 1μg/ml,相当于 3 5× 10 -8M。进一步的实验仍在进行中。