外周血指标对鼻息肉患者黏膜中IL-5和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E阳性表达的预测价值

目的借助外周血指标预测慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)2型生物标志物。方法收集2020年6月~2022年5月在北京同仁医院鼻科住院的CRSwNP患者临床资料,检测外周血中嗜酸粒细胞百分比(Eos%)、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE以及CRSwNP黏膜中白细胞介素5(IL-5)和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E(Staphylococcus aureus enterotoxinimmunoglobulin E,SE-IgE)。应用受试者工作特征(ROC)曲线评估每个外周血指标对黏膜IL-5/SE-IgE阳性表达预测价值,利用Logistic回归筛选对黏膜IL-5/SE-IgE阳性有预测价值的外周血指标,构建诺模图模型。结果CRSwNP患者哮喘比例、血中Eos%、骨膜蛋白和总IgE在IL-5/SE-IgE阳性和阴性两组之间,均具有统计学差异。ROC曲线单因素分析显示血Eos%、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE对黏膜IL-5和SE-IgE阳性预测的AUC分别波动在0.655~0.784和0.721~0.802,Logistic回归确认血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE可分别作为IL-5和SE-IgE阳性的独立预测因素。构建预测CRSwNP黏膜IL-5/SE-IgE阳性的诺模图模型,一致性指数(C-index)为0.804和0.81,提示具有很好的预测准确性。结论血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE分别构建的诺模图,对CRSwNP黏膜IL-5和SE-IgE阳性表达具有很好的预测价值,可以预判CRSwNP内型和表型严重性。

医务人员鼻定植金黄色葡萄球菌的筛查和spa分型

目的 了解医务人员鼻腔金黄色葡萄球菌定植情况,以及鼻定植金黄色葡萄球菌spa类型与psmmec、pvl、qacA/B、mecA基因分布。方法 收集复旦大学附属上海市第五人民医院247名医务人员鼻拭子,采用质谱仪进行菌种鉴定。采用聚合酶链反应(PCR)检测spa类型和psm-mec、pvl、qacA/B、mecA基因。采用自动化鉴定药敏仪进行甲氧西林敏感性试验。采用高通量测序技术对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)进行分子分型。结果 医务人员鼻腔金黄色葡萄球菌定植率为23.89%(59/247),MRSA定植率为4.45%(11/247)。鼻定植金黄色葡萄球菌主要spa类型依次为t084(8/59,13.56%)、t309(5/59,8.47%)和t338(5/59,8.47%)、t034(4/59,6.78%)、t701(3/59,5.08%)。基于spa基因构建的进化树将鼻定植金黄色葡萄球菌归为3个主要进化支。MRSA分离株以ST398-t034-SCCmecⅤ型(36.36%,4/11)为主,甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)分离株以t084型(16.67%,8/48)为主,MRSA和MSSA菌株spa类型分布差异有统计学意义(χ^(2)=49.843,P=0.017)。psm-mec、pvl、qacA/B、mecA基因检出率分别为3.39%(2/59)、11.86%(7/59)、6.78%(4/59)、18.64%(11/59)。psm-mec(χ^(2)=59.000,P=0.001)、pvl(χ^(2)=40.582,P<0.001)和mec A(χ^(2)=18.724,P=0.001)在不同spa类型中的分布差异有统计学意义。结论 医务人员鼻定植金黄色葡萄球菌spa类型多样,MRSA的SCCmec类型和ST类型多样,毒力基因和耐药基因在不同spa类型中存在分布差异。

金黄色葡萄球菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系的构建

目的建立金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)巨噬细胞胞内感染状态下分泌蛋白高通量筛选体系,探索金葡菌胞内生存所需关键分泌蛋白。方法利用课题组建立的金葡菌分泌蛋白真核系统表达载体库,通过DNA转染表达技术,得到能够在细胞内表达金葡菌分泌蛋白的RAW264.7巨噬细胞阵列。金葡菌感染RAW264.7后,清除胞外菌,观察金葡菌胞内生存情况。最后通过构建相应分泌蛋白的过表达及敲除金葡菌验证筛选结果。结果通过探索RAW264.7质粒转染剂量、金葡菌感染复数(multiplicity of infection,MOI)以及感染时间,确立筛选体系的最优质粒转染剂量为1.0μg/孔、MOI为1.0、感染时间为4 h。筛选结果结合相应分泌蛋白过表达和敲除菌株验证,成功筛选出hypothetical protein、Serine protease E等分泌蛋白具有促进胞内金葡菌生存功能。结论成功构建金葡菌巨噬细胞胞内生存关键分泌蛋白筛选体系。

金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal Protein A， SPA）分泌型融合表达系统

金黄色葡萄球菌蛋白Ａ（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＰｒｏｔｅｉｎＡ，ＳＰＡ）分泌型融合表达系统李节，邱平（南京大学生物化学系医药生物技术国家重点实验室，南京２１０００８）引言十几年前，我们制备蛋白质的方法还主要依靠从天然组织或细胞中提取，而现在人们可...

MLKL对金黄色葡萄球菌诱导的炎症介质分泌及炎症信号通路激活的影响

【目的】金黄色葡萄球菌是一种革兰阳性共生细菌,是一种胞内菌,其利用坏死性凋亡在人和动物宿主中引起多种疾病。本研究旨在了解混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain like protein,MLKL)是否参与调控金黄色葡萄球菌感染所致炎性反应,为防控金黄色葡萄球菌感染所致疾病提供新思路与理论依据。【方法】通过转录组测序分析Pam2CSK4和金黄色葡萄球菌SA113刺激前后小鼠巨噬细胞中基因的变化;通过分子对接技术分析Pam2CSK4与MLKL的对接方式及位点;通过实时荧光定量PCR对差异表达基因进行验证;通过Western blotting检测MLKL、p65、p38和ERK的磷酸化水平;通过ELISA方法检测促炎性细胞因子(肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β))、趋化因子(RANTES)和抗炎因子(IL-10)的分泌水平。【结果】转录组分析结果表明,Pam2CSK4和金黄色葡萄球菌SA113刺激巨噬细胞后可导致坏死性凋亡相关基因表达,且MLKL基因相关度较高(P<0.05)。分子对接预测结果显示,Pam2CSK4与MLKL蛋白结合良好,并与ARG-304、ARG-301、GLN-331和LYS-333氨基酸残基形成氢键。实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,与未刺激组相比,Pam2CSK4和金黄色葡萄球菌SA113刺激可诱导小鼠巨噬细胞中MLKL的磷酸化和基因表达水平极显著上调(P<0.01)。表明MLKL参与金黄色葡萄球菌感染过程。通过Western blotting检测MLKL对NF-κB和MAPK信号通路激活的影响,结果显示,与C57BL/6J小鼠相比,在金黄色葡萄球菌SA113刺激30和60 min后,MLKL^(-/-)小鼠巨噬细胞中p65磷酸化水平显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01);而在Pam2CSK4刺激30和60 min后,MLKL^(-/-)小鼠巨噬细胞中p65磷酸化水平极显著下调(P<0.01);在Pam2CSK4刺激15、30和60 min后,MLKL^(-/-)小鼠巨噬细胞中ERK磷酸化水平极显著下调(P<0.01);Pam2CSK4和金黄色葡萄球菌SA113刺激60 min后,MLKL^(-/-)小鼠巨噬细胞中p38磷酸化水平显著或极显著下调(P<0.05;P<0.01)。与C57BL/6J小鼠相比,Pam2CSK4刺激后,MLKL^(-/-)小鼠巨噬细胞上清液中TNF-α和RANTES分泌水平均极显著升高(P<0.01);SA113刺激后,MLKL^(-/-)小鼠巨噬细胞上清液中TNF-α、IL-1β和RANTES分泌水平均极显著升高(P<0.01),IL-10分泌水平极显著降低(P<0.01)。【结论】MLKL对金黄色葡萄球菌诱导的炎症介质分泌及炎症信号通路激活具有调控作用。

金黄色葡萄球菌Spa蛋白在不同感染类型中的差异分析

目的对临床采集的82例金黄色葡萄球菌进行DLST-spa基因扩增、测序及生物信息学分析,探讨金黄色葡萄球菌Spa蛋白在定植及感染中的异同。方法收集入院患者不同来源的标本及临床资料,经VITEK MS质谱仪鉴定进行药物敏感性测试与冻存;复苏菌株,扩增DLST-spa目的基因;运用生物信息数据库分析DLST-spa基因序列,比较不同来源标本中分离出的金黄色葡萄球菌Spa蛋白的异同,探讨Spa蛋白在定植及感染的金黄色葡萄球菌中的表达差异。结果 82株金黄色葡萄球菌菌株DLST-spa基因核苷酸主要的突变种类为A-T,G-T,A-G及C-T突变。菌株来源于静脉血、无菌体液的DLST-spa基因相较于痰、咽拭子标本存在更多突变,且在MRSA中突变频率更高;同时Spa X区蛋白长度在金黄色葡萄球菌定植或感染中存在差异,菌株来源于静脉血、无菌体液的Spa X区蛋白相较于痰、咽拭子的长度更短,且在MRSA中Spa X区蛋白长度相较于MSSA更短。结论来源于无菌体液标本感染中的金黄色葡萄球菌DLST-spa基因的突变种类和数量更多,Spa X区蛋白长度更短;相较于社区感染,来源于院内感染中分离的金黄色葡萄球菌DLST-spa基因的突变种类和数量更多,Spa X区蛋白长度更短。

金黄色葡萄球菌耐药机制及治疗药物

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起局部化脓和心内膜炎等多种感染的重要人兽共患革兰阳性病原菌。其传播速度快,致病力强,且耐药性日益严重,给全球公共卫生安全和动物养殖业造成了巨大威胁。这对深入了解金黄色葡萄球菌耐药机制以及药物新靶点的开发提出了迫切需求。因此,本文对当前临床使用的抗生素的作用机制和耐药机理进行了综述,并特别关注了相关领域的最新研究进展,以期望为临床防治细菌耐药和新药研制提供新的视角和参考。

金黄色葡萄球菌临床分离株spa分型和耐药特征研究

目的研究临床分离金葡菌的耐药性和分子特征。方法对2011年5—11月在成都某医院分离的56株金葡菌进行抗菌药物敏感性检测,检测菌株携带mecA基因和pvl基因情况,并进行spa基因分型分析。结果 56株金葡菌中,共检出耐甲氧西林金葡菌(MRSA)21株(37.5%),其中mecA基因阳性20株(95.2%);甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)35株(62.5%)。与MSSA相比,MRSA对利福平、左氧氟沙星、莫西沙星、环丙沙星、庆大霉素和四环素的敏感率显著降低(P<0.05),MRSA对万古霉素、利奈唑胺、替加环素、喹奴普丁-达福普汀和呋喃妥因全部敏感。MRSA分为6个spa型别,以t030(66.7%)为主,MRSA-t030、MRSA-t002具有突出的多药耐药特征。MSSA共分为18个spa型别,以t189、t377和t034列前3位,分别占14.3%、14.3%和11.4%,并在脓液标本检出1株新spa基因型new1。检出5株杀白细胞毒素(PVL)阳性菌株,其中3株为MSSA-t189。结论 t030是医院MRSA临床分离株中的spa优势型别,具有突出的多药耐药特征,在医院内广泛传播。MSSA遗传多样性高,以t189、t377和t034列前3位。

牛源金黄色葡萄球菌spa基因多态性分型研究

目的为了研究引起奶牛乳房炎的主要病原菌金黄色葡萄球菌的35个分离株进行spa基因多态性分型研究。方法在河北、内蒙古、山东、黑龙江、湖北、河南等省份采集奶牛乳房炎奶样,经实验室分离鉴定,从中择35株金黄色葡萄球菌,采用PCR方法扩增spa基因的X区域,测序后根据数据库(http://www.ridom.de/spaserver/)进行分型。结果35株菌可分成11个型,分别为t521型有8株,t518型和t2788型各5株,t246型和t519型各4株,t359型和t2756型各3株,t189型t、224型t、267型t、2759型各有1株;同时发现3个新型,分别为t2788、t2756t、2759。结论研究显示spa基因分型方法具有快速、分辨力强、易于标准化等特点,可用于牛源金黄色葡萄球菌的基因分型及生态学等研究。

医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Spa和SCCmec分型研究

目的对医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(HA-MRSA)A蛋白(Spa)和葡萄球菌mec基因盒(SCCmec)分型同源性研究,为预防和控制医院感染提供依据。方法采用药敏纸片法(K-B法)、SCCmec分型及Spa分型技术,收集自2013年8月至2014年4月80株HA-MRSA,进行药敏试验和同源性分析,并检测毒力基因杀白细胞毒素(pvl)基因和毒性休克综合征(tsst)基因。结果药敏结果显示,80株HA-MRSA对青霉素、氨苄西林/舒巴坦、亚胺培南均耐药,对环丙沙星耐药率为90.0%,对克林霉素耐药率为58.8%,对复方磺胺类耐药率为13.8%,对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁均敏感。SCCmec分型结果显示,80株MRSA中SCCmecⅡ型占73.75%、SCCmecⅢ型(13.75%)、SCCmecⅤ型(12.5%)。Spa分型,28株为t2460型(35%)、9株为t002型(11%)、6株为t030型(8%)、7株为t632型(9%)、5株为t037型(6%),其他Spa型相对分散。pvl基因阳性率为7.5%(6株),tsst基因为阴性。结论 HA-MRSA SCCmec分型以Ⅱ为主,Spa分型以t2460型为主,有较高的同源性;HA-MRSA对多种药物具有较高的耐药性并且存在多重耐药。

金黄色葡萄球菌重组GapC蛋白的GAPDH活性及免疫原性分析

为研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表面GapC蛋白的GAPDH活性、免疫原性及免疫保护作用,应用PCR方法扩增出S.aureus的gapC基因,插入到pQE-30载体相应位点,构建重组质粒pQE/gapC。将其导入宿主菌E.coliM15(pREP4)后,IPTG诱导表达。重组蛋白纯化后进行GAPDH活性检测,并与灭活全菌体分别免疫健康家兔。然后,应用ELISA方法检测血清中IgG抗体水平及IFN-γ、IL-4细胞因子浓度,并用1.0×108CFU/mLS.aureus菌株Wood46对免疫家兔攻毒。SDS-PAGE结果显示,GapC蛋白在E.coliM15(pREP4)中获得表达;经GAPDH活性检测及WesternBlot检测,重组蛋白具有较高的GAPDH活性和抗原特异性;经ELISA检测,GapC蛋白及全菌体组兔血清中IgG抗体水平迅速升高,并在加强免疫后第28天达到最高(1:64000),加强免疫后第14d,血清中细胞因子IFN-γ和IL-4浓度与对照组相比,显著升高(P<0.05),而全菌体免疫组升高不明显(P>0.05);攻毒结果为蛋白免疫组家兔获得一定的免疫保护(4/5)。以上结果表明,表达的重组GapC蛋白具有GAPDH活性、较好的免疫原性及免疫保护力,可作为深入研究S.aureus基因工程疫苗的良好靶向。

金黄色葡萄球菌SPA基因的克隆、表达及纯化

目的:构建携带StaphylococcalproteinA(SPA)基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的SPA。方法:用PCR从金黄色葡萄球菌基因组中扩增SPA基因并克隆入pET32a(+)载体中,在大肠杆菌BL21〈DE3〉中表达。表达产物经亲和层析进行纯化。结果:所构建的原核表达载体为高效表达载体,工程菌表达的SPA约占菌体总蛋白的40%,经亲和层析纯化后获得SPA,纯度达到99%。结论:成功地建立了制备及纯化SPA的方法,为SPA大量生产以及构建SPA融合表达体系奠定了基础。

丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在金黄色葡萄球菌α-毒素所致人外周血单核细胞凋亡中的作用

目的研究丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在金黄色葡萄球菌α-毒素所致人外周血单核细胞凋亡中的作用。方法以Annexin V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染流式细胞仪检测人外周血单核细胞的凋亡率,以Western blot法检测p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK)及c-Jun N末端激酶(JNK)等蛋白的表达。结果随着α-毒素作用时间的延长,磷酸化-p38 MAPK和JNK1/2等蛋白的表达逐渐增高,而磷酸化-ERK1/2蛋白的表达不变。用SB203580和SP600125阻断p38 MAPK和JNK1/2后,单核细胞凋亡率明显降低,分别为(17.7±1.8)%和(15.3±1.6)%,与感染60 min时(35.7±3.6)%比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MAPK信号通路的成员p38 MAPK和JNK1/2在金黄色葡萄球菌的致病过程中起重要作用。

金黄色葡萄球菌蛋白质相互作用网络及功能

【目的】金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌,是目前最难以对付的病菌之一。它能引起多种感染,特别是在医院环境中。近年来,抗药性金黄色葡萄球菌传染更加严重,已成为公共卫生威胁。由于以前对于金黄色葡萄球菌的实验性研究大都是基于单个基因或者蛋白进行的,为了更好的研究这个物种,有必要从整体上把握金黄色葡萄球菌的蛋白作用机理。【方法】采用系统发生谱、操纵子法、基因融合法、基因邻近法、同源映射法等5种计算方法预测金黄色葡萄球菌蛋白质相互作用网络。【结果】从蛋白组的角度构建了金黄色葡萄球菌蛋白相互作用网络,并对网络进行功能分析。【结论】网络的分析表明金黄色葡萄球菌的蛋白质相互作用网络也服从scale-free属性,发现了SA0939、SA0868、rplD等重要的蛋白。通过对金黄色葡萄球菌的重要的细胞壁合成和信号转导调控蛋白局部网络分析,发现了一些对这两个系统十分重要的蛋白分子,这些信息将为更好的了解金黄色葡萄球菌的致病机理和开发新的药物靶点提供指导。

金黄色葡萄球菌的蛋白A基因多态性分型

目的建立金黄色葡萄球菌的蛋白A基因(spa)多态性分型方法,并初步测定了结核患者鼻腔定植的金黄色葡萄球菌的spa基因型。方法采用PCR方法扩增10株金黄色葡萄球菌spa基因的X区,测序后通过数据库(http://www.ridom.de/spaserver/)进行分型,并与脉冲场凝胶电泳(PFGE)结果相比较。结果5例患者抗结核治疗前后前鼻腔定植的金黄色葡萄球菌spa分型相同,结果与PFGE一致。5例患者定植的金黄色葡萄球菌spa型分别为:t795、t179、t189、t758和t796,其中t795、t758和t796为新发现的型。结论spa分型是一个较好的金黄色葡萄球菌快速基因分型方法。

牛源金黄色葡萄球菌铁离子调控蛋白保守性和免疫效果研究

为评价金黄色葡萄球菌铁离子调控蛋白B(IsdB)作为奶牛乳腺炎疫苗抗原的可能性,对我国分离的不同克隆复合群(CCs)3株菌的isdB基因进行序列测定、比对分析,并对XJ43(CC97)菌株的isdB基因进行原核表达、纯化,通过小鼠主动和被动免疫试验评价了其免疫保护效果。Blast分析显示,来源于不同克隆复合群菌株的isdB基因序列的同源性大于95%,说明isdB基因高度保守;IsdB蛋白主动免疫能显著降低攻毒菌对免疫鼠的损伤或免疫鼠的死亡率,而被动免疫不能降低小鼠的死亡率;用活的强毒力菌刺激产生的血清则能极显著地增加小鼠的存活率。本研究表明,虽然IsdB蛋白的主动免疫可以显著减弱金黄色葡萄球菌的致病作用,但以此单一成分为抗原的金黄色葡萄球菌疫苗的免疫保护效果具有很大的局限性。

金黄色葡萄球菌表面蛋白研究进展

金黄色葡萄球菌是一种常见的人兽共患病的病原菌。通过其表面蛋白(黏附素)与宿主的细胞外基质结合感染宿主,这些蛋白的结构已从分子水平上得到揭示。本文综述了金葡菌产生的表面蛋白及其主要蛋白的分子结构。

进出口食品中金黄色葡萄球菌spa基因的分型

目的对我国进出口食品中分离得到的金黄色葡萄球菌进行spa基因分型。方法对36株金黄色葡萄球菌的spa基因进行PCR扩增,并对产物进行测序分析,测序结果通过数据库进行spa基因分型。结果共分出16个基因型,分别为t189、t091、t164、t002、t899、t197、t1044、t034、t156、t7400、t2592、t4209、t127、t437和两株新发现的基因型。其中t189型共有13株,t091型共4株,t164和t002型分别为3株,其余型分别为1株。结论 食品中分离出的36株金黄色葡萄球菌spa分型以t189居多,t091型次之,其他14型相对较少。

金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrD的原核表达及抗体制备

根据金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrD基因序列设计特异性引物,以金黄色葡萄球菌标准菌株基因组为模板进行PCR扩增,获得了大小为2 043bp的基因片段。将基因片段连接至表达载体pET26b,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明,SdrD基因获得了较好的表达,重组蛋白的分子质量约为99ku。利用免疫亲和层析对目标蛋白进行纯化,获得了纯度较高的目标蛋白。用该蛋白免疫新西兰白兔制备了多克隆抗体,抗体效价达到1∶23 000,为金黄色葡萄球菌基因工程疫苗的开发与性能评价,以及该致病菌免疫检测技术的开发奠定了基础。

应用葡萄球菌A蛋白快速检测金黄色葡萄球菌的诊断价值

目的评价应用葡萄球菌A蛋白(SPA)快速检测金葡菌的临床诊断价值。方法 200株鉴定明确的菌株(金葡菌和非金葡菌各100株)采用SPA法检测,统计检测方法的灵敏度和特异度;118份ICU患者的痰标本,采用双盲法分别对其进行传统痰培养鉴定和SPA镜下快速检测,计算该诊断试验的评价指标,并对痰培养和SPA方法的相关性进行分析。结果 SPA检测的灵敏度和特异度均为100%;双盲法痰标本SPA检测敏感度为100%,特异度97.7%,SPA检测和痰培养的结果呈高度相关性(P>0.05)。结论 SPA检测法可早期诊断金葡菌感染,是一项快速的、灵敏度和特异度较高的诊断试验。