PCR技术检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素基因的实验研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素的PCR方法，以期用于葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断。方法根据文献报道选择金葡菌SEA基因中比较保守的片段设计引物，优化各种工作条件，建立PCR检测方法，并鉴定其敏感性和特异性以及抗杂菌干扰性。扩增片段应用限制性核酸内切酶RsAI消化进行分析。结果所建立的方法敏感性和特异性均较好，有较强的抗杂菌干扰能力。结论应用PCR法检测SEA基因为SEA基因的诊断提供了病因学基础。

外周血指标对鼻息肉患者黏膜中IL-5和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E阳性表达的预测价值

目的借助外周血指标预测慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)2型生物标志物。方法收集2020年6月~2022年5月在北京同仁医院鼻科住院的CRSwNP患者临床资料,检测外周血中嗜酸粒细胞百分比(Eos%)、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE以及CRSwNP黏膜中白细胞介素5(IL-5)和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E(Staphylococcus aureus enterotoxinimmunoglobulin E,SE-IgE)。应用受试者工作特征(ROC)曲线评估每个外周血指标对黏膜IL-5/SE-IgE阳性表达预测价值,利用Logistic回归筛选对黏膜IL-5/SE-IgE阳性有预测价值的外周血指标,构建诺模图模型。结果CRSwNP患者哮喘比例、血中Eos%、骨膜蛋白和总IgE在IL-5/SE-IgE阳性和阴性两组之间,均具有统计学差异。ROC曲线单因素分析显示血Eos%、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE对黏膜IL-5和SE-IgE阳性预测的AUC分别波动在0.655~0.784和0.721~0.802,Logistic回归确认血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE可分别作为IL-5和SE-IgE阳性的独立预测因素。构建预测CRSwNP黏膜IL-5/SE-IgE阳性的诺模图模型,一致性指数(C-index)为0.804和0.81,提示具有很好的预测准确性。结论血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE分别构建的诺模图,对CRSwNP黏膜IL-5和SE-IgE阳性表达具有很好的预测价值,可以预判CRSwNP内型和表型严重性。

基于荧光生物传感技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的利用纳米金粒子(gold nanoparticles,AuNPs)荧光猝灭性能和核酸适配体的高亲和力,构建一种简便、灵敏的纳米金“Turn-on”型荧光生物传感方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxins B,SEB)的方法。方法以AuNPs作为荧光体的能量受体(猝灭剂),荧光素-单链DNA(fluorescein-ssDNA,FAM-ssDNA)作为荧光能量供体,冷冻法制备AuNPs-SEB适配体复合物,基于AuNPsSEB适配体复合物/SEB/FAM-ssDNA的竞争性结合,构建纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测方法。对缓冲体系pH和反应时间等条件进行优化,以牛奶为代表对方法检测性能进行验证。结果在优化好的实验条件(pH 7.5、反应时间15 min和反应温度25℃)下,在10^(-1)~10^(4)ng/mL范围内,荧光强度与SEB质量浓度之间呈现良好的线性关系,其相关系数为0.995,检出限为0.062 ng/mL。应用于牛奶样品中SEB的测定,方法回收率为91.2%~108.0%,相对标准偏差在2.6%~5.2%范围之间。结论该纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测技术具有简便、灵敏和准确等优点,可为食品中污染物的检测提供一种可行的新方法。

1株马乳源PVL+ST22型金黄色葡萄球菌致病性分析

国内鲜有马乳源PVL+ST22型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)相关报道,本研究对1株新疆马乳源PVL+ST22型金黄色葡萄球菌的致病性进行评估,以期为马乳源金黄色葡萄球菌的相关研究提供基础数据。使用选择性培养基从新疆健康马乳中分离金黄色葡萄球菌,然后通过生化鉴定和分子鉴定方法对金黄色葡萄球菌进行鉴定。对所获得的金黄色葡萄球菌进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、spa分型、药物敏感性检测、生物被膜形成能力、溶血活性、毒力基因检测、小鼠皮肤脓肿和致病性试验。再对分离株进行小鼠细胞的黏附、侵袭和胞内增殖试验,以评估其致病性。结果显示,从马乳中分离得到1株PVL+ST22型金黄色葡萄球菌(1/65,1.5%),spa分型为t304。仅对青霉素耐药,无生物被膜形成能力,但携带9种毒力基因(sec、seg、seh、tsst-1、hla、hlb、clfA、clfB和cna),并且具有溶血活性。小鼠皮肤脓肿和致病性试验表明,其可导致小鼠形成皮肤脓肿,并且在高剂量感染时可导致小鼠死亡。ST22型金黄色葡萄球菌可在小鼠巨噬细胞中黏附(4.26%)、侵袭(6.45%)和胞内增殖,并可造成细胞凋亡。综上,马乳源PVL+ST22型金黄色葡萄球菌具有较强的致病力,可能在宿主致病和公共卫生安全等方面存在隐患。

基于裁剪适配体的纳米金比色法用于金黄色葡萄球菌肠毒素A的可视化检测

目的:筛选适配体作为分子识别原件,基于纳米金的盐效应构建生物传感器,实现金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)的快速定量检测。方法:采用分子对接和分子动力学模拟对SEA适配体进行截短指导和结果预测,利用纳米金显色法验证模拟结果,对SEA适配体优化并将其作为分子识别原件,优化反应体系,探讨SEA质量浓度与吸光度比值间的关系,构建一种可视化的SEA快速检测分析方法,并对方法的准确度、精密度和特异性进行评价。结果:筛选出一条序列短、亲和力高、特异性强且稳定的SEA适配体,建立了一种基于纳米金比色的SEA可视化检测方法,检出限低,加标回收结果满意。结论:采用分子模拟能有效提高适配体筛选效率,本方法可用于SEA快速检测。

金黄色葡萄球菌A型肠毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏、特异的金黄色葡萄球菌A型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin A,SEA)检测方法。【方法】以原核表达的可溶性重组SEA蛋白为免疫原,获得特异性强、亲和力高的单克隆抗体作为捕获抗体,同时制备抗SEA兔多抗血清作为检测抗体建立双抗体夹心ELISA(Double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法。【结果】该方法对SEA的线性检测区间为2-128μg/L(y=1.102x-0.07,R2=0.994),检测下限为1.89μg/L,与SEB、SEC2和SED之间无交叉反应;鲜奶SEA人工污染试验测定回收率为94%-114%,变异系数小于10%。应用该方法对46株金黄色葡萄球菌水产品分离株和164株奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌分离株的体外培养上清进行检测,阳性率分别为4.4%和50.6%,表明SEA污染普遍存在。【结论】建立的DAS-ELISA方法特异性、灵敏度和稳定性好,为检测SEA的食源性污染提供了有效手段。

产A型肠毒素金黄色葡萄球菌的筛选及其重组表达

目的分离产A型肠毒素金黄色葡萄球菌标准株,克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA),研究其生物学特征。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,亚克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达和纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得抗血清,进行重组蛋白免疫原性分析。结果成功克隆SEA全长基因,经DNA序列分析证实与GenBank收录序列具有100%的同源性。表达蛋白相对分子质量为31000,以包涵体形式存在。纯化、复性后获得有活性的rSEA蛋白,rSEA蛋白能够识别天然的SEA。结论SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,rSEA具备抗原性,为制备单抗、诊断试剂及金黄色葡萄球菌致病机制研究奠定了基础。

乌鲁木齐生牛乳中金黄色葡萄球菌的肠毒素检测及分离株同源性分析

探究乌鲁木齐生牛乳中金黄色葡萄球菌经典肠毒素携带情况及分离株同源性差异,为金黄色葡萄球菌的防控提供参考。对乌鲁木齐地区采集的131份生牛乳样品采用特异性选择培养基结合PCR方法分离鉴定金黄色葡萄球菌,并通过PCR方法检测金黄色葡萄球菌5种经典肠毒素(sea、seb、sec、sed、see)携带情况和根据测序结果对分离株进行同源性分析。结果显示,共分离鉴定到金黄色葡萄球菌13株,总分离率为9.92%(13/131);13株金黄色葡萄球菌经典肠毒素阳性菌株5株,阳性率为38.46%;13株金黄色葡萄球菌的同源性在93.7%~99.7%之间,遗传差异在0.3~6.6之间。研究表明,该地区生牛乳中存在一定金黄色葡萄球菌的污染,经典肠毒素阳性率较高,不同来源的分离株同源性高、差异性小。

一起餐馆疑似金黄色葡萄球菌肠毒素所致食源性疾病事件调查

目的:分析并查明一起由金黄色葡萄球菌肠毒素导致的餐馆食源性疾病事件,以期预防此类食品安全事件的发生,为临床治疗提供依据。方法:采用现场流行病学调查方法中的描述性研究方法,按照《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》(GB 4789.10—2016)进行检验,同时检测葡萄球菌肠毒素。结果:此次事件疑似为一起由金黄色葡萄球菌肠毒素污染不明食品引起4人出现腹泻、呕吐等症状的事件。结论:应加强餐饮行业人员卫生培训,餐馆卫生监督管理,避免该类事件再次发生,以保障食品安全。

度普利尤单抗对成人中重度特应性皮炎金黄色葡萄球菌定殖的影响

目的:明确度普利尤单抗治疗成人中重度特应性皮炎对金黄色葡萄球菌定殖的影响及作用机制。方法:选取2022年7月至2023年8月中重度特应性皮炎患者作为实验组,健康体检者作为对照组。实验组接受度普利尤单抗治疗,分别在治疗前、治疗8周后检测实验组皮损处和对照组对应部位金黄色葡萄球菌定殖量及血清IL-4,IL-13,IL-19,IL-33及总IgE水平。结果:治疗前实验组(30例)金黄色葡萄球菌的定殖率为100%,健康组(30名)为3.33%(P<0.05);治疗8周后,实验组金黄色葡萄球菌定殖量[(3394±1837)CFU/cm^(2)]较治疗前[(108741±56758)CFU/cm^(2)]明显降低,有统计学意义;血清IL-4、IL-13、IL-19、IL-33及总IgE水平较治疗前显著降低,有统计学差异(P<0.05)。AD积分指数(SCORAD)评分、湿疹面积及严重程度指数(EASI)评分、瘙痒严重程度(NRS)评分治疗后均显著降低。结论:度普利尤单抗可以降低成人中重度特应性皮炎患者皮损处金黄色葡萄球菌定殖量,可能与2型炎症因子水平和特应性皮炎严重程度的降低相关。

新疆乌鲁木齐市周边乳源金黄色葡萄球菌的污染和致病力评价

为了评价新疆乌鲁木齐市周边乳源金黄色葡萄球菌污染和致病力,从奶牛养殖场和挤奶厅采集了414份样品,共分离鉴定出51株金黄色葡萄球菌(总分离率为12.3%),其中粪样、吸奶器拭子、体表拭子、乳样、饲料的分离率分别为8.4%、22.8%、14.8%、18.9%、9.8%。采用PCR检测毒力基因的携带情况,SEs的总检出率为60.8%,其中sec、seh和sel的检出率为51.0%、43.1%和23.5%。其他毒力基因hla和hlb、clfa的检出率为52.9%和84.3%、90.2%。菌株耐药率较高的抗生素是阿奇霉素(86.3%)、磺胺二甲嘧啶(84.3%)、万古霉素(49.0%)、环丙沙星(29.4%)、阿莫西林-克拉维酸钾(27.5%)。其中多重耐药有34株,最高可达6重耐药。乌鲁木齐市周边乳源金黄色葡萄球菌的污染较严重,且肠毒素基因携带率较高和耐药严重,需要重视金黄色葡萄球菌的污染和减少抗菌药物的使用。

金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的免疫治疗策略

金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的一类具有呕吐活性的细菌外毒素,可引起严重的炎症反应和食物中毒。SEs具有超抗原活性,可与T细胞受体的可变区和MHC Ⅱ类分子形成三元复合物(TCR-SEs-MHC Ⅱ),直接刺激T淋巴细胞大量产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-2、IL-6和γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)等细胞因子,从而导致中毒性休克综合征(toxicshocksyndrome,TSS)。在临床常见的SEs中,肠毒素A(staphylococcalenterotoxin A,SEA)和肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)是出现频率最高、毒性最大、危害最严重的两种。目前尚没有针对SEs中毒治疗策略的综述性研究。本文首先概述了SEs的分类、结构及毒性作用,重点围绕SEA和SEB,分析了TCR-SEs-MHC II类分子相互作用位点,最后总结了针对SEs中毒的主动免疫疗法和被动免疫疗法,本文为SEs的深入研究提供了必要信息。

食源性金黄色葡萄球菌分离株肠毒素及耐药性分析

目的:对92株食源性金黄色葡萄球菌分离株进行肠毒素及耐药性检测,以了解其致病性和耐药性。方法:采用酶联免疫吸附试验测定食源性金黄色葡萄球菌分离株肠毒素携带情况,利用VITEK®2 Compact全自动微生物分析系统对菌株进行药敏试验,采用聚合酶链式反应对菌株mecA耐药基因进行检测。结果:92株食源性金黄色葡萄球菌分离株肠毒素检出率为5.43%(5株),对青霉素、四环素、红霉素、克林霉素4种抗生素的耐药率较高,分别为100%、30.43%、19.57%、14.13%,检出3株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。结论:食源性金黄色葡萄球菌分离株产生的肠毒素不容忽视,多重耐药及MRSA的检出提示耐药形势比较严峻,加强对食源性金黄色葡萄球菌致病性和耐药性的监测,对降低食品安全风险有重要意义。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的培养产毒与柱层析纯化

本文采用玻璃纸覆盖琼脂平板法,在37℃培养金黄色葡萄球菌48h后,收集菌体,10000×g离心15min,上清液经聚乙二醇20000浓缩。浓缩液依次经羧甲基阳离子交换纤维素CM-32层析和葡聚糖凝胶SephadexG-75过滤纯化,获得电泳纯的金黄色葡萄球菌B型肠毒素。实验证明,利用该简化的二步柱层析分离得到的金黄色葡萄球菌B型肠毒素完全能满足血清学检实验和鉴定的要求,方法简便易行,一般实验室均可使用。

金黄色葡萄球菌新型肠毒素I双抗夹心-酶联免疫检测方法的建立

目的:建立简便、灵敏检测金黄色葡萄球菌肠毒素I(staphylococcal enterotoxin I,SEI)的双抗夹心酶联免疫吸附方法(double-antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)。方法:利用DAS-ELISA检测程序确定单克隆抗体、抗血清、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗兔Ig G(Ig G/HRP)的最佳稀释度,再通过检测不同包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、Ig G/HRP作用时间以及四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)显色时间条件下的OD450 nm值对实验条件进行优化,最后用灵敏度、批内变异、批间变异和加标回收率指标对方法进行评价。结果:抗SEI单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为2.89 mg/L,抗SEI兔血清稀释度1∶2 000,酶标二抗稀释度1∶6 000;1×磷酸缓冲盐溶液(p H 7.4)为最佳包被缓冲液;最佳封闭时间、抗原孵育时间、酶标二抗孵育时间和TMB显色时间分别为60、90、30 min和15 min。该方法的回归方程为y=0.040 9x+0.042 9,R2=0.993 3;灵敏度为0.5μg/L,精密度批内变异低于10%,批间变异低于15%,除巴氏杀菌牛乳外,对生理盐水、熟牦牛肉糜、大米饭和超高温瞬时灭菌牛乳回收率达90%以上。结论:本研究建立了一种快速检测SEI的双抗夹心方法。

牛奶中金黄色葡萄球菌的耐药性及其肠毒素分型研究

为了解我国部分生鲜牛奶中金黄色葡萄球菌污染状况和耐药情况,为指导奶牛场安全合理用药和保障消费者食品安全提供依据。采集3个省共6个奶牛场及挤奶站的新鲜牛奶进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定、药敏试验以及分离菌肠毒素PCR分型。结果从338份生鲜牛奶中共分离鉴定金黄色葡萄球菌共39株,分离率为11.54%;所有分离菌株都有不同程度的耐药,尤其对磺胺类药物和青霉素类的耐药性非常严重;92.3%的菌株含SEA SAJ基因肠毒素。

金黄色葡萄球菌新型肠毒素sek基因在3株食品分离菌株中的表达

目的：肠毒素sek基因在临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株中较为流行,研究新型肠毒素sek基因的时序性表达可为食物中毒预防和疾病控制补充新的基础数据。方法：本研究针对实验室保存的食源性金黄色葡萄球菌菌株进行21种肠毒素基因检测,筛选出3株含sek基因的菌株SA005、SA008和SAB0,针对3株菌株进行生长曲线测定,随后在培养不同时间段收集菌体提取RNA,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction,real time-PCR）检测肠毒素sek基因在12~120 h的相对表达水平。结果：基因检测结果显示,菌株SA005含有16S、nuc、mec A、seb、sec、sek、sex基因,SA008含有16S、nuc、mec A、sea、sek、sex基因,SAB0含有16S、nuc、sek、sex基因。3株菌株在胰酪胨大豆肉汤培养基中的生长曲线趋势较相似,18 h左右出现折点,之后细菌进入生长稳定期。3株菌株的sek基因在12~120 h全程表达,SA005的sek基因在48 h时相对表达量最高,在84 h相对表达量最低;SA008在24 h时的相对表达量最高,在48 h相对表达量最低,在60~120 h表达量相对比较稳定;SAB0在12~120 h之间相对表达量呈现抛物线趋势,在60 h和72 h的表达量相对较高且差异不显著（P〉0.05）。结论：3株菌株sek表达水平存在明显差异,相同菌株sek基因不同时间点表达也存在差异性,菌株基因背景的影响可能是造成sek基因表达差异性的关键。

金黄色葡萄球菌耐药性及肠毒素分型研究

为了解从生鲜乳中分离得到的31株金黄色葡萄球菌的耐药性和肠毒素分布情况,用微量肉汤稀释法进行药敏试验,用PCR方法进行肠毒素的检测和分型。结果表明,31株金黄色葡萄球菌耐药率在50%以上的抗菌药有7种,药耐药率小于10%的有3种;敏感率大于50%的抗菌药有6种,敏感率小于10%的有5种。31株金黄色葡萄球菌毒素基因携带率为93.5%,同时携带2种及以上毒素的菌株占67.7%,有SEA基因的占38.7%,含其他传统的毒素基因类型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占40.4%,携带新发现的毒素基因SEG、SHE、SEI和SEJ的菌株占67.7%。说明本次试验中的31株金黄色葡萄球菌对6类13种抗菌药都有不同程度的耐药性,且多重耐药现象比较严重。生鲜乳中分离的金黄色葡萄球菌带毒率高,且携带新发现的肠毒素基因较多。

金黄色葡萄球菌肠毒素B对豚鼠哮喘模型Th1/Th2细胞因子的影响

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)对豚鼠支气管哮喘(简称哮喘)模型气道炎症及Th1/Th2细胞因子的影响。方法27只豚鼠随机分为对照组,模型组,SEB组各9只,用卵白蛋白(OVA)建立哮喘模型。末次激发豚鼠24-48 h内处理,支气管肺泡灌洗,直接记数总白细胞和嗜酸性粒细胞,观察肺组织病理改变,分装冻存支气管肺泡灌洗液做细胞因子检测。结果SEB组豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量为(2.6±0.64)×106,显著低于模型组的(13.0±1.8)×106(P<0.01);肺组织哮喘炎症反应也轻于模型组;SEB组肺泡灌洗液中Th1细胞因子IFNγ-浓度(126.41±5.17)pg/mL,高于模型组(86.52±5.10)pg/mL(P<0.05);而Th2细胞因子IL-4浓度(50.02±2.79)pg/mL低于模型组(78.30±3.88)pg/mL(P<0.05)。结论SEB能减少哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量,可以通过调节Th1/Th2细胞因子的比值来减轻气道哮喘炎症反应。