分泌抗金黄色葡萄球菌C1型肠毒素杂交瘤细胞系的建立及初步应用

应用常规方法建立了３株稳定分泌抗金黄色葡萄球菌Ｃ１型肠毒素（ＳＥＣ１）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的小鼠杂交瘤细胞系Ｂ３、Ｃ４和Ｇ８。其中Ｂ３和Ｃ４均为ＩｇＧ１（ｋ），Ｇ８为ＩｇＧ２ａ（ｋ）。Ｂ３和Ｇ８与ＳＥＡ、ＳＥＢ及ＳＥＤ均无交叉反应；Ｃ４虽与ＳＥＡ和ＳＥＤ无交叉反应，但与ＳＥＢ有交叉反应。间接ＥＬＩＳＡ测定小鼠腹水效价为１０－５～１０－８。应用识别不同表位的ＭｃＡｂ建立了双ＭｃＡｂ夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＳＥＣ１，敏感性可达１ｎｇ／ｍｌ。

多重PCR方法快速检测牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型

针对金黄色葡萄球菌肠毒素基因A,B,C,D(SEA,SEB,SEC,SED)设计了特异性引物,并以其耐热核酸酶nuc基因作为阳性对照,运用多重PCR方法建立金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型的快速检测方法,通过优化多重PCR反应体系及条件,得到最优组合。结果表明,该方法特异性好、检测效率高、能够同时对4种肠毒素进行分型,其中SEA,SEB,SEC,SED的检测灵敏度达到0.072,0.072,0.2268,0.198 g/L,适合运用于牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素的快速检测。

PCR技术检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素基因的实验研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌A型肠毒素的PCR方法，以期用于葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断。方法根据文献报道选择金葡菌SEA基因中比较保守的片段设计引物，优化各种工作条件，建立PCR检测方法，并鉴定其敏感性和特异性以及抗杂菌干扰性。扩增片段应用限制性核酸内切酶RsAI消化进行分析。结果所建立的方法敏感性和特异性均较好，有较强的抗杂菌干扰能力。结论应用PCR法检测SEA基因为SEA基因的诊断提供了病因学基础。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2的基因克隆、表达及其生物学活性

利用PCR技术从金黄色葡萄球菌的基因组DNA中克隆SEC2全长基因,PCR产物与pGEM-T载体连接,经测序证实后进行亚克隆,构建其表达载体pET-28a-SEC2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达成熟重组蛋白(rSEC2),纯化rSEC2蛋白并对其生物学活性进行研究. 结果表明:成功克隆了SEC2全长基因,测序证实该基因共717 bp,编码239个氨基酸,与GenBank中收录的SEC2成熟蛋白质序列完全一致,SEC2基因登录GenBank(Accession number:AY450554);构建了SEC2的表达载体pET-28a-SEC2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效可溶性表达,可溶性的rSEC2经Ni2+亲和层析纯化达到电泳纯,纯化的rSEC2蛋白经蛋白质印迹检测,并能有效刺激人外周血单个核细胞的增殖,被rSEC2刺激的外周血单个核细胞在体外对肿瘤细胞的生长有显著的抑制作用.

金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分型和分布

目的:建立金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测方法。初步研究生牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布状况。方法:应用PCR扩增经分离鉴定的金黄色葡萄球菌肠毒素基因SEA-SEJ,电泳检测扩增结果。结果:建立了金黄色葡萄球菌肠毒素基因PCR检测方法。从生牛奶中分离的29株金黄色葡萄球菌检测到SEA-SED和SEG-SEJ基因,没有检测到SEE基因。毒素基因携带率为65.5%,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占37.9%。有SEA基因的占51.7%,含其它传统的毒素基因类型SEB、SEC、SED和SEE基因的菌株只占17.2%,携带新发现的毒素基因SEG、SEH、SEI和SEJ的菌株占41.4%。结论:建立的PCR检测金黄色葡萄球菌的肠毒素基因的方法可用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因分型和分布的研究。研究表明,生牛奶中分离的金黄色葡萄球菌带毒率高,而且携带新发现的肠毒素基因的较多。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的培养产毒与柱层析纯化

本文采用玻璃纸覆盖琼脂平板法,在37℃培养金黄色葡萄球菌48h后,收集菌体,10000×g离心15min,上清液经聚乙二醇20000浓缩。浓缩液依次经羧甲基阳离子交换纤维素CM-32层析和葡聚糖凝胶SephadexG-75过滤纯化,获得电泳纯的金黄色葡萄球菌B型肠毒素。实验证明,利用该简化的二步柱层析分离得到的金黄色葡萄球菌B型肠毒素完全能满足血清学检实验和鉴定的要求,方法简便易行,一般实验室均可使用。

金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究

目的 :探讨金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )L型肠毒素B的产生量及其基因存在情况。方法 :将金葡菌诱导成稳定L型后 ,用ELISA法检测葡萄球菌肠毒素B(SEB) ,用PCR法检测SEB基因。结果 :金葡菌L型SEB的产生量与原菌比差别无显著性 (P >0 .0 5 ) ,PCR发现 4 78bp的阳性条带。结论 :金葡菌变异为L型后SEB产生量不变 ,其基因也未丢失。

产A型肠毒素金黄色葡萄球菌的筛选及其重组表达

目的分离产A型肠毒素金黄色葡萄球菌标准株,克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA),研究其生物学特征。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,亚克隆到表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达和纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得抗血清,进行重组蛋白免疫原性分析。结果成功克隆SEA全长基因,经DNA序列分析证实与GenBank收录序列具有100%的同源性。表达蛋白相对分子质量为31000,以包涵体形式存在。纯化、复性后获得有活性的rSEA蛋白,rSEA蛋白能够识别天然的SEA。结论SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,rSEA具备抗原性,为制备单抗、诊断试剂及金黄色葡萄球菌致病机制研究奠定了基础。

产B型肠毒素金黄色葡萄球菌及其L型某些致病物质的比较

目的 :比较产B型肠毒素金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )及其L型的某些致病物质。方法 :检测金葡菌L型产生血浆凝固酶、耐热核酸酶及肠毒素B的情况 ,并与原菌进行比较。结果 :金葡菌L型使血浆延迟至 2 4h发生凝固 ,耐热核酸酶的透明环减小 ,肠毒素B的光密度 (OD)值未见明显减少。结论 :金葡菌L型仍能产生致病物质 。

热诱导潜在食物中毒威胁源重组M型金黄色葡萄球菌肠毒素去折叠及聚合过程

热失活工艺是降低加工食品中潜在的细菌和毒素含量的有效手段。M型金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins M,SEM)归属于V型超抗原,具有较弱的催吐活性,是一种潜在的金黄色葡萄球菌所致食物中毒威胁源。本研究利用圆二色光谱、荧光光谱、变性/活性聚丙烯酰胺凝胶电泳监测重组M型金黄色葡萄球菌肠毒素(recombinant staphylococcal enterotoxin M,rSEM)热诱导变性过程。结果表明,在低于40℃时,rSEM具有富含α-螺旋(17%)、β-折叠(32%)、转角(21%)的天然折叠态结构,分子表面唯一的121号色氨酸残基位于β-掌型结构域中相对疏水的环境中。随着温度从42℃升高到55℃,rSEM二级结构中减少的α-螺旋含量被增加的β-折叠/转角含量所弥补,蛋白质分子之间聚集状态未发生明显改变,最大荧光发射波长明显蓝移,同时350 nm和340 nm波长处的荧光强度比表现出反S型曲线,说明42~55℃温和加热可导致另一种形式的rSEM折叠中间态(intermediate state,IS)形成。在55~90℃温度范围内,rSEM二级结构基本维持稳定。与此同时,当加热温度从65℃升高至80℃时,350 nm与340 nm波长处的荧光发射强度比并未显示出蛋白处于完全变性状态,说明在加热过程中rSEM二级结构基本维持稳定,而三级结构具有较大动态变化的可能性,这可能与β-掌型结构域可以通过诱导契合结合具有不同构象的主要组织性相容复合体等位基因产物有关系。此外,在70℃乃至更高的温度,rSEM的聚集程度明显增加并且在90℃时达到最大。综上,rSEM中间态形成、聚合体产生以及稳定的β-折叠/转角结构是该蛋白在高温下依然保持热稳定性的基础。通过对rSEM热诱导去折叠过程的研究有助于阐明rSEM耐热机理,未来利用该方法对其他各类金葡菌肠毒素热失活机制进行类似研究将利于食品安全性生产工艺过程的改善。

PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素C的快速敏感PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌肠毒素C基因编码序列,设计1对PCR引物来特异性扩增靶基因片段,片段长度为600 bp,通过对1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株和5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株进行检测来评价该方法的特异性;对金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株做一系列10倍稀释后进行PCR检测,并对其进行敏感性分析,对PCR扩增产物进行电泳和测序鉴定。结果1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应呈阳性,5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应为阴性;通过基因测序证实了PCR产物的特异性;PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的检测下限为1.5×102cfu/ml。结论本研究建立了一个快速、特异、敏感的金黄色葡萄球菌肠毒素C基因PCR检测方法。

金黄色葡萄球菌M型肠毒素原核表达、纯化、鉴定及溶液构象分析

葡萄球菌肠毒素M是由金黄色葡萄球菌νSa基因岛编码的分泌型超抗原。本研究将截去N端信号肽的金黄色葡萄球菌M型肠毒素(staphylococcal?enterotoxin?M,SEM)蛋白编码基因亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),构建重组表达质粒p ET-28a(+)-ΔNspsem;随后转化感受态E.coli?Rosetta(DE3)并探讨融合蛋白最佳表达条件;利用Ni2+-Sepharose?4?Fast?Flow亲合层析纯化出His-ΔNsp SEM融合蛋白;经质谱鉴定,纯化的融合蛋白对SEM的氨基酸覆盖率达96.3%;凝血酶切除6×His标签肽后,圆二色谱分析表明ΔNsp SEM重组蛋白富含β-折叠(35%)和β-转角(21%)以及较少α-螺旋(16%)等二级结构;荧光发射谱揭示ΔNsp SEM在278?nm和295?nm波长处激发时具有相同的Trp发射峰(341?nm);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析表明ΔNsp SEM重组蛋白表现出较高的热稳定性。研究结果表明重组蛋白SEM表达成功,纯化的ΔNsp SEM重组蛋白溶液构象紧密并具有接近天然状态的结构,这为深入研究SEM蛋白的结构与功能提供理论支持。

金黄色葡萄球菌肠毒素C_2对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的实验研究

目的观察不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)对体外兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的诱导分化作用。方法以梯度密度离心法获得rBMSCs并通过激光共聚焦对细胞进行形态学鉴定后传代培养,分别应用1、10、100、500μM SEC2处理细胞,检测各组细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的增殖情况;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测骨桥蛋白和胶原蛋白的基因表达。结果 rBMSCs在应用SEC2诱导时,随着浓度的增加,rBMSCs的增殖逐渐被抑制,其中100μM SEC2共培养细胞增殖情况明显高于对照组(P<0.01);应用100μM SEC2诱导rBMSCs 16d后,成骨诱导检测茜素红染色可见矿化和钙沉积;同时进行RT-PCR检测,随着培养时间的延长,骨桥蛋白(Osteopontin)和胶原蛋白-1(Collagen I)有明显上调趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SEC2能够使rBMSCs成骨分化,分化的效果与肠毒素剂量及诱导时间相关。

金黄色葡萄球菌肠毒素C的原核表达、纯化及活性鉴定

目的:在大肠杆菌中表达金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC),并对其活性进行检测。方法:以金黄色葡萄球菌基因组为模板扩增SEC基因,经测序正确后插入原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α后温度热诱导重组SEC表达;表达产物经阳离子柱纯化后,用ELISA鉴定其抗原性;通过观测表达产物对鼠脾淋巴细胞的刺激增殖情况,检测其超抗原活性。结果:构建了SEC-pBV220原核表达载体,在大肠杆菌中可快速、高效表达SEC蛋白,表达产物具有超抗原活性。结论:实现了SEC的原核表达。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的酶联免疫检测

[目的]为细菌毒素的检测提供理论依据。[方法]以BALB/c小白鼠为免疫对象,以自制的高纯度金黄色葡萄球菌B型肠毒素（SEB）为免疫抗原,研究其抗体的产生过程和效价,并建立SEB的间接竞争ELISA检测方法。[结果]自制SEB纯度较高,能较好地刺激动物产生抗体。以自制SEB为免疫抗原注射BALB/c小白鼠,其最高效价为1∶100 000。SEB浓度在1-1 000 ng/ml范围内,竞争抑制率与SEB浓度的对数值呈显著线性关系。当SEB的浓度为5-500 ng/ml时,随样品中SEB浓度的增加,污染样品的回收率变异系数减小,检测准确度提高。[结论]对不同污染程度的牛奶样品,利用间接竞争ELISA法检测其SEB残留的灵敏度远远高于生化法。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的酶联免疫检测研究

目的探讨金黄色葡萄球菌B型肠毒素的酶联免疫检测的临床应用价值。方法本次研究的对象是小白鼠,将本院自制的金黄色葡萄球菌B型肠毒素作为免疫抗体,研究这种抗体在产生过程中的作用,采用金黄色葡萄球菌B型肠毒素间接竞争酶联免疫吸附试验（ELISA）检验方式对其进行检验,总结出金黄色葡萄球菌B型肠毒素的酶联免疫检测在细菌霉素中检测的理论依据。结果本院自制的金黄色葡萄球菌B型肠毒素纯度较高,能够与金黄色葡萄球菌B型肠毒素的浓度呈现出线性关系。在本次研究过程中,小白鼠最高效价为1：10000。从本次试验中发现,当金黄色葡萄球菌B型肠毒素的浓度在2～1000 ng/ml范围中时竞争性抑制率与金黄色葡萄球菌B型肠毒素浓度10～450 ng/ml时样品中的金黄色葡萄球菌B型肠毒素浓度会随之增加。结论采用金黄色葡萄球菌B型肠毒素的酶联免疫检测这种方式应用于检测中具有极强的价值,灵敏度较高,能够检测出样品中金黄色葡萄球菌B型肠毒素的残留情况。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的构象研究

采用扫描电镜、X-射线衍射仪、原子力显微镜、傅立叶红外光谱仪等现代结构分析手段,对金黄色葡萄球菌B型肠毒素的蛋白质聚集态结构、立体形貌、分子链构象等进行较为系统的结构表征。结果表明:SEB结构中有结晶区的形成,结晶度为37.8%,SEB分子聚集在一起,形态主要为片状和平板状,具有一定的规整性;SEB在稀溶液状态下其单分子链长度约为1500nm,分子链宽度约为20～40nm,分子链高0.6nm;SEB是一种β-折叠结构含量较多的蛋白质。

金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ型蛋白的表达研究

为了研究金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ型的检测方法,诱导融合表达并纯化金黄色葡萄球菌肠毒素Ⅰ型蛋白,试验根据Gen Bank中SEⅠ的序列设计一对特异性引物,采用PCR技术从金黄色葡萄球菌中扩增出新型肠毒素Ⅰ型基因,亚克隆入p EASY-E1载体中,构建重组质粒p EASY-E1-SEⅠ,以IPTG诱导表达,镍柱纯化表达蛋白,用His标签单克隆抗体进行免疫印迹分析验证融合蛋白的表达。结果表明:成功扩增出SEⅠ基因,片段大小为507 bp,重组质粒高效表达SEⅠ融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定成功表达了分子质量约为26 ku的重组蛋白,Western-blot检测表明目的蛋白具有良好的免疫原性。说明表达系统p EASY-E1/BL21能高效表达金黄色葡萄球菌新型肠毒素Ⅰ蛋白。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因定点突变分析

目的利用金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因His118定点突变,以获得超抗原性保持不变的减毒肠毒素。方法利用PCR介导的定点突变技术,对SEc2基因中的His118密码子进行定点突变,得到的带有突变基因的表达质粒在大肠埃希菌中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达。采用镍离子金属整合(Ni-NTA)亲和层析和凝胶过滤层析纯化突变体蛋白,并测定突变体蛋白超抗原性及体外抑瘤效果。结果应用点突变试剂盒,PCR扩增得到SEc2突变体表达质粒pET-28a-SEC2(H118Y)在1mmol/LIPTG诱导下高效表达。突变体蛋白SEC(H118Y)在2～200 ng时刺激人体细胞增殖效果与SEC2基本一致,体现二者具有相同的超抗原性。SEC(H118Y)时,在2～200 ng与SEC2抑制大肠癌细胞Cx-1效果基本相同,而在500 ng时,SEC(H118Y)抑瘤效果明显优于与SEC2。结论SEC(H118Y)超抗原性和抑瘤活性没有因His118位点的突变而改变。