重组金黄色葡萄球菌FnbpA亚单位疫苗的研制

【目的】制备金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)基因工程亚单位疫苗,并以小白鼠为试验模型,检测其免疫保护效果。【方法】诱导表达FnbpA,经组氨酸标签亲合纯化后用Bradford法测定纯化的目的蛋白的含量,并检测其黏附活性及对动物的安全性。制备FnbpA亚单位疫苗,经无菌检验及安全检验后,进行免疫保护试验,用ELISA方法检测被免疫小鼠血清中的抗体效价,通过腹腔攻毒试验检测疫苗的免疫保护力。【结果】纯化的目的蛋白在80 ku处出现单一条带,蛋白质量浓度为0.245 mg/mL。细菌黏附抑制试验发现,经FnbpA蛋白预处理过的MDBK细胞黏附的金黄色葡萄球菌数较对照极显著减少;动物安全性试验显示,小鼠注射FnbpA亚单位疫苗后均健活,表明制备的FnbpA亚单位疫苗安全性良好。所有免疫组小鼠于首免后7 d即可在血清中检测到特异性抗体,抗体效价逐渐上升,在21 d达到最高值,之后逐渐降低。【结论】纯化的FnbpA蛋白达到了电泳级纯度,且依然保持良好的黏附活性;制备的FnbpA亚单位疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律,且表现出良好的免疫保护力。

牛源金黄色葡萄球菌FnbpA-A基因克隆及抗原表位预测

据GenBank上公布的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(fibronection-binding protein A,FnbpA)基因序列,设计1对引物特异性扩增FnbpA基因A区(FnbpA-A),然后对其进行克隆、测序、蛋白二级结构分析及抗原表位预测。结果表明,FnbpA-A基因全长1645bp,编码548个氨基酸,与金黄色葡萄球菌CIG1835株同源性达100%;该蛋白含α螺旋13.69%、β折叠30.84%、β转角11.86%和无规则卷曲43.61%;B细胞表位可能位于N端31—46、54—69、142—157、303—318、324—339、450—465、491—506和533—548区段;T细胞表位可能位于N端353—361和245—253区段。综上所述,FnbpA-A可作为后续金黄色葡萄球菌基因工程亚单位疫苗候选基因筛选区域。

新疆奶牛乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌FnbpA基因的克隆与序列分析

采集新疆奶牛隐性乳腺炎乳样,经分离、鉴定,从中得到金黄色葡萄球菌,参考GenBank中发表的FnbpA基因序列,用Oligo 6.0软件设计一对特异性引物。提取分离株中的基因组DNA,经PCR扩增得到1 654 bp的目的片段FnbpA,将其插入PMD18-T克隆载体中构建PMD18-FnbpA重组质粒,将其转入到大肠杆菌DH5α中,并进行测序分析。结果表明,克隆的FnbpA基因片段全长1 654 bp,共编码314个氨基酸。分析表明,FnbpA蛋白基因潜在的蛋白质抗原决定簇有17个,抗原性很强,与16株FnbpA基因标准序列的同源性为77.1%-100%,本研究所克隆的FnbpA基因与AM990992株亲缘性最近。

金黄色葡萄球菌FnBPA D基因片段的表达

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要传染性病原菌。本实验采用分子克隆及蛋白表达技术,成功的表达了金黄色葡萄球菌纤维素结合蛋白A(FnBPA)D片段并对其免疫学活性进行了初步研究。表达产物免疫实验动物后,获得较高效价的抗体。用制备血清进行吞噬调理试验,抗金黄色葡萄球菌黏附等一系列试验,证明抗体对金黄色葡萄球菌具有吞噬调理作用,也有抗金黄色葡萄球菌黏附的作用,这将为制备奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌黏附素疫苗奠定基础。

金黄色葡萄球菌FnbpA、ClfA、Ebps抗原表位的串联表达及多克隆抗体的制备

为获得金黄色葡萄球菌特异性抗原蛋白并以此制备多克隆抗体,应用DNAStar软件筛选金黄色葡萄球菌FnbpA、Clf A、Ebps的抗原表位,以柔性氨基酸序列连接后进行全基因合成,将目的基因克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化至大肠杆菌感受态细胞,诱导表达,采用Sepharose 4B柱亲和层析纯化表达蛋白,制备抗原后对家兔进行皮下多点注射,于第42天采集外周血,获得血清。结果表明,本试验成功构建了金黄色葡萄球菌抗原基因表达载体,并获得了高免血清,经ELISA的方法检测血清效价可达到1∶10000以上,成功制备多克隆抗体,为以后采用免疫学方法快速检测金黄色葡萄球菌奠定了基础。

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌FnBPA蛋白免疫研究

为了研究奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌发病机制和治疗措施,对引起奶牛临床型和隐性乳腺炎的337株金黄色葡萄球菌进行FnBPA蛋白基因分子调查,并且表达和纯化了FnBPA蛋白,制作FnBPA蛋白疫苗进行动物免疫试验。结果表明,FnBPA蛋白基因携带率为51. 04%,临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌FnBPA蛋白基因的携带率为68. 5%。选取分离菌株10A扩增出的FnBPA基因,进行原核表达,重组蛋白得到高效表达,获得高纯度的FnBPA蛋白,BCA法蛋白定量为2. 8 mg/mL,制作蛋白疫苗免疫3头试验奶牛,30～40 d后,ELISA检测血清抗体滴度达到高峰,最高抗体滴度达到7l og_2,该蛋白具有很好的抗原性。

基于金黄色葡萄球菌FnBPA和停乳链球菌GapC的多表位疫苗免疫原性研究

金黄色葡萄球菌和链球菌是奶牛乳腺炎的重要致病菌,为了研究预防金黄色葡萄球菌和链球菌感染的奶牛乳腺炎新型疫苗,以金黄色葡萄球菌FnBPA的1个CD4^(+)T细胞表位和两个B细胞表位构建了FTB1B2表位疫苗,以停乳链球菌GapC的1个CD4^(+)T细胞表位和两个B细胞表位构建了GTB1B2表位疫苗,再以GSGSGS作为Linker,串联FTB1B2与GTB1B2构建了表位疫苗FG;串联了FnBPA的CD4^(+)T细胞表位FT和GapC的CD4^(+)T细胞表位GT构建了表位疫苗FGT。通过免疫接种BALB/c小鼠评价疫苗的免疫原性。结果显示,FT、GT和FGT仅能诱导细胞免疫应答,并不能显著抑制金黄色葡萄球菌或停乳链球菌在肝、脾、肺、肾各器官的定殖数;FG诱导细胞和体液免疫应答能力显著高于GT、FGT和GST,显著低于FTB1B2和GTB1B2;FG免疫小鼠各器官细菌定殖数显著低于FT、GT、FGT和GST,显著高于FTB1B2和GTB1B2,但能够同时抑制金黄色葡萄球菌和停乳链球菌在各器官的定殖。结果表明,研究构建的FG表位疫苗能够诱导良好的免疫应答,并能同时抑制攻毒小鼠器官中金黄色葡萄球菌和停乳链球菌的定殖。

金黄色葡萄球菌FnbpA的CD4^+ T细胞表位鉴定

金黄色葡萄球菌(S.aureus)表达的菌体表面纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)在感染早期与宿主细胞粘附过程中起关键作用,将其免疫小鼠后能够诱导机体产生强烈的Th1和Th17反应。但FnbpA诱导Th1和Th17反应的CD4^+ T细胞表位尚不清楚。本研究根据FnbpA二级结构及其与MHCⅡ分子的结合能力对CD4^+ T细胞表位进行预测与分析,选择并合成7个候选CD4^+ T细胞表位肽。将每个表位肽分别对FnbpA免疫的C57BL/6小鼠CD4^+ T细胞进行体外刺激,通过检测CD4^+ T细胞增殖及其分泌的细胞因子水平对免疫优势表位进行初步鉴定。再以初步鉴定的优势表位肽段免疫小鼠,并检测其诱导的特异性细胞免疫应答水平。结果表明,表位肽F5(FnbpA488-505)能够显著诱导CD4^+ T细胞增殖并分泌高水平IFN-γ和IL-17A,而且F5在不同S.aureus菌株中高度保守。表明FnbpA_(488-505)是诱导CD4^+ T细胞分化为Th1/Th17的T细胞表位。本研究为S.aureus的FnbpA表位肽疫苗的进一步设计提供了实验依据。

基于RNA-seq鉴定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳房炎的关键应答基因

该研究旨在通过转录组测序技术发掘金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型奶牛乳房炎相关的关键应答基因,为发掘乳房炎防治有关的生物标志物奠定基础。于体外采用金黄色葡萄球菌处理MAC-T建立了金黄色葡萄球菌乳房炎细胞模型,并进行了转录组测序。同时从公共数据库中收集了9份金黄色葡萄球菌和大肠杆菌处理的乳腺上皮细胞转录组测序样本,结合生物信息分析技术进行了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳房炎关键应答基因的发掘。结果发现,乳腺上皮细胞中与金黄色葡萄球菌处理显著关联的差异表达基因有449个,其中上调差异基因有223个,下调差异基因有226个;另有347个差异表达基因与大肠杆菌处理显著关联,其中上调的差异表达基因116个,下调的差异表达基因有231个。功能富集分析发现,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳腺上皮细胞中的差异表达基因主要富集到IL-17信号通路。蛋白质互作分析发现,383个金黄色葡萄球菌型乳房炎特异性差异表达基因形成了21个调控网络,其中最大的调控网络包含了67个差异表达基因。另外,281个大肠杆菌乳房炎特异性差异表达基因形成了16个调控网络,其中最大的调控网络包含了33个差异表达基因。利用Cytoscap插件CytoHubba进一步筛选出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳房炎的关键应答基因各10个。这些关键应答基因的发掘将为进一步阐明金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳腺炎的发生发展作用机制奠定基础。

骨折内固定术后感染金黄色葡萄球菌患者的耐药监测及临床分析

目的 分析金黄色葡萄球菌在骨折内固定术后感染患者中的耐药情况。方法 回顾性分析四川省骨科医院2016年1月至2020年12月骨折内固定术后确诊为金黄色葡萄球菌感染的临床病例,共收集金黄色葡萄球菌467株。根据药物敏感性实验分为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)组(145株)和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)组(322株),分析比较2组对常见抗菌药物的耐药情况。统计2016—2020年万古霉素对MRSA最低抑菌浓度(MIC)。结果 金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率达94.9%(443/467),对红霉素、克林霉素、苯唑西林、四环素耐药率较高,对左氧氟沙星、利福平、复方磺胺甲噁唑片、莫西沙星的耐药率较低[8.4%(39/467)、5.8%(27/467)、3.6%(17/467)、3.0%(14/467)],未发现对万古霉素、利奈唑胺、达托霉素耐药的菌株,万古霉素中介3株。MRSA组和MSSA组对克林霉素、苯唑西林、红霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、青霉素、利福平、复方磺胺甲噁唑片、四环素的耐药率比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。万古霉素对MRSA的MIC为2 mg/L的比例较高。结论 金黄色葡菌球菌引起的骨折内固定术后感染MRSA检出率较高,万古霉素MIC=2 mg/L的比例较高,降低了万古霉素治疗骨折内固定术后感染的达标率,且万古霉素骨组织渗透率不高,增加了临床治疗难度。因此万古霉素骨水泥植入,联合万古霉素静脉用药,或万古霉素静脉用药与利福平、喹诺酮类、磺胺类、利奈唑胺等联合用药可能是治疗骨折内固定术后感染的较好选择。

食源性金黄色葡萄球菌生物膜形成调控与生物防控策略研究进展

生物膜是很多食源性致病菌应对各种极端环境、杀菌理化因子以及维持菌体内环境稳定的重要基质屏障。数据显示,有超过80%的细菌感染由生物膜引起,尤以金黄色葡萄球菌感染多见。食源性金黄色葡萄球菌是引发细菌性食物中毒和食品安全事故的重要风险源,特别是多重耐药菌株。金黄色葡萄球菌的耐药性、致病性和免疫逃逸与生物膜复杂的三维结构有重大关系。由于生物膜结构基因和调控因子结构相对保守,现已成为金黄色葡萄球菌生物防控新的重要的效应靶点。本文从多糖细胞间黏附素、胞外DNA和生物膜形成相关蛋白等角度阐明了生物膜形成机制,从群体感应系统(如Agr系统和LuxS/AI-2群体感应系统)、全局性调控因子(如附属调节因子Sar和转录因子SigB)及双组分信号转导系统(如SrrAB系统、SaeRS系统、ArlRS系统、LytRS系统和WalKR系统)等角度系统阐述了生物膜形成调控机制。最后,从抗菌肽(蛋白)、植物源化合物、生物酶、抗菌药物等角度提出新的防控策略,以期为食源性金黄色葡萄球菌的生物防控提供指导。

百里香酚对犊牛源生物被膜阳性金黄色葡萄球菌耐药性的消除作用

为了了解内蒙古地区犊牛病料中生物被膜阳性金黄色葡萄球菌的流行情况、耐药情况及百里香酚对生物被膜阳性金黄色葡萄球菌耐药性的消除作用。本试验采用生化鉴定和PCR方法,对采集到的104份犊牛病料进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定;采用K-B法检测了金黄色葡萄球菌分离株对18种抗菌药物的敏感性;采用改良结晶紫染色法测定分离株的生物被膜形成能力;选取2株生物被膜强阳性菌株,采用微量肉汤稀释法测定百里香酚对分离株的最小抑菌浓度,并进行百里香酚耐药性消除试验。结果显示,在104份犊牛病料中共分离鉴定获得43株金黄色葡萄球菌。药敏试验结果显示,金黄色葡萄球菌分离株对氨苄西林、头孢西丁、卡那霉素、复方新诺明和红霉素5种抗菌药物的耐药率达到50.0%以上;74.4%(32/43)的分离株为多重耐药株。生物被膜形成能力强、中、弱和无生物被膜形成能力的分离株分别占比23.3%(10/43)、16.3%(7/43)、32.6%(14/43)和27.9%(12/43);生物被膜阳性株中83.9%(26/31)为多重耐药株。百里香酚对2株生物被膜强阳性株的最小抑菌浓度均为256 mg/mL,经百里香酚处理后均恢复了对头孢噻肟的敏感性。结果表明,百里香酚对生物被膜阳性金黄色葡萄球菌具有一定的耐药消除作用。

外周血指标对鼻息肉患者黏膜中IL-5和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E阳性表达的预测价值

目的借助外周血指标预测慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)2型生物标志物。方法收集2020年6月~2022年5月在北京同仁医院鼻科住院的CRSwNP患者临床资料,检测外周血中嗜酸粒细胞百分比(Eos%)、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE以及CRSwNP黏膜中白细胞介素5(IL-5)和金黄色葡萄球菌肠毒素特异性免疫球蛋白E(Staphylococcus aureus enterotoxinimmunoglobulin E,SE-IgE)。应用受试者工作特征(ROC)曲线评估每个外周血指标对黏膜IL-5/SE-IgE阳性表达预测价值,利用Logistic回归筛选对黏膜IL-5/SE-IgE阳性有预测价值的外周血指标,构建诺模图模型。结果CRSwNP患者哮喘比例、血中Eos%、骨膜蛋白和总IgE在IL-5/SE-IgE阳性和阴性两组之间,均具有统计学差异。ROC曲线单因素分析显示血Eos%、Eos计数、骨膜蛋白和总IgE对黏膜IL-5和SE-IgE阳性预测的AUC分别波动在0.655~0.784和0.721~0.802,Logistic回归确认血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE可分别作为IL-5和SE-IgE阳性的独立预测因素。构建预测CRSwNP黏膜IL-5/SE-IgE阳性的诺模图模型,一致性指数(C-index)为0.804和0.81,提示具有很好的预测准确性。结论血中Eos%、总IgE和血中骨膜蛋白、总IgE分别构建的诺模图,对CRSwNP黏膜IL-5和SE-IgE阳性表达具有很好的预测价值,可以预判CRSwNP内型和表型严重性。

一起金黄色葡萄球菌引起的学校食物中毒的流行病学调查与实验室分析

目的对一起学校食物中毒事件发生的原因和可疑危险因素进行流行病学调查与实验室分析,提出有效防控措施。方法利用现场流行病学与卫生学调查,了解患病情况及可疑食物;采集可疑食品、外环境和病例的标本进行荧光定量PCR检测、金黄色葡萄球菌分离与鉴定、药物敏感性分析、全基因组测序。结果共11名患者,其临床症状主要是恶心、腹痛(100%),其次为呕吐(81.82%);可疑食物为某饼家生产的“脆皮法棍泡芙”,致病因素为金黄色葡萄球菌A型肠毒素,来源于食品泡芙样本的金黄色葡萄球菌和来源于患者肛拭子样本的金黄色葡萄球菌具有同源性,所检出的金黄色葡萄球菌均对青霉素耐药(耐药率100%)。结论本次食物中毒事件是由某饼家从业人员携带金黄色葡萄球菌,在制作“法棍泡芙”过程中污染食物而引起的金黄色葡萄球菌A型肠毒素中毒。

金银花对金黄色葡萄球菌体外抑菌作用研究

目的比较金银花对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)和甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)体外抑菌活性差异。方法收集30株MSSA和30株MRSA菌,使用头孢西丁筛选试验和mecA基因检测对菌株进行验证,使用琼脂打孔法检测金银花对两类金黄色葡萄球菌的抑菌活性并比较差异,使用琼脂稀释法检测金银花对两类金黄色葡萄球菌的MIC并计算出MIC_(50)。结果金银花对MSSA和MRSA均有体外抑菌活性且MIC_(50)均为3.125 mg/mL。结论金银花对MSSA和MRSA均有较好的体外抑菌活性,在临床治疗金黄色葡萄球菌感染方面有很大的应用前景。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致新生儿坏死性筋膜炎1例

本研究报道1例以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染致右背部皮肤红肿、局部呈黑紫色坏死起病的新生儿,诊断为MRSA新生儿坏死性筋膜炎(NF),同时合并脓毒血症、感染性休克。经早期呼吸循环支持、切开引流、抗感染、外科清创并负压封闭引流(Vacuum sealing drainage,VSD)联合邮票状皮片移植技术治疗后,患儿病情好转出院。本研究旨在为MRSA致新生儿NF的早期诊治提供策略,同时推广邮票状皮片移植技术在新生儿NF中的应用,提高新生儿存活率。

6种中药水提物对金黄色葡萄球菌体外生物被膜形成的影响

试验旨在探究苦参、连翘、白头翁、蒲公英、黄柏和五倍子等6种中药水提物对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响。通过银染法和结晶紫染色法检测6种中药水提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的黏附和抑制作用。结果显示,中药水提物减少了金黄色葡萄球菌生物被膜的黏附;与对照组相比,在6种中药水提物作用下,金黄色葡萄球菌生物被膜洗脱液的OD_(590nm)值均极显著降低(P<0.01),其中五倍子水提物的抑制效果最优,抑制率为74.9%。研究表明,6种中药水提物均能够抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成,其中五倍子水提物效果最好。

项目综合管理策略在重症监护病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染防控中的应用

目的 探讨项目综合管理策略在重症监护病房(ICU)落实耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染防控措施中的应用效果,为降低MRSA医院感染发生率提供循证依据。方法 选取2020-01-2021-12月某三甲医院5个ICU中住院患者送检标本并经微生物培养分离出MRSA的患者为研究对象。2020年为基线调查,2021年实施项目综合管理策略。比较干预前后各项防控措施落实执行情况、手卫生依从性、患者MRSA检出情况和MRSA检出科室分布情况。结果 实施项目综合干预管理策略后,MRSA防控措施的落实情况优于干预前,差异有统计学意义(P<0.05)。各类人员手卫生依从性均有提高,差异有统计学意义(P<0.05)。干预后患者MRSA检出率由35.71%降至27.73%。MRSA检出科室分布情况显示除呼吸内科ICU持平,其他ICU检出率均下降。结论 项目综合管理策略提高了MRSA感染防控措施的执行力和有效性,降低了MRSA检出率,减少了患者感染MRSA的风险,可保障医疗安全。

中药混合液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用的研究

目的探究中药混合液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus Sureus,MRSA)的体外抗菌作用。方法选取2022年1月—2023年6月江苏省启东市中医院检验科临床分离的40株MRSA。万古霉素、中药混合液对MRSA的体外最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)值采用微量肉汤稀释法测定;用K-B纸片扩散法测定万古霉素和中药混合液对MRSA的抑菌效果,探究不同药物浓度对MRSA抑菌活性的影响。结果万古霉素MIC值为(1.56±0.55)mg/L,低于中药混合液的(1.63±0.62)mg/mL,差异有统计学意义(P<0.05)。万古霉素抑菌圈直径为(20.56±0.87)mm,优于中药混合液的(19.89±0.73)mm,差异有统计学意义(P<0.05)。抑菌圈直径大小随浓度增加而增大且中药混合液各浓度抑菌圈直径均大于万古霉素,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论中药混合液对MRSA的体外最低抑菌浓度极低,可以有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。

基于荧光生物传感技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的利用纳米金粒子(gold nanoparticles,AuNPs)荧光猝灭性能和核酸适配体的高亲和力,构建一种简便、灵敏的纳米金“Turn-on”型荧光生物传感方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxins B,SEB)的方法。方法以AuNPs作为荧光体的能量受体(猝灭剂),荧光素-单链DNA(fluorescein-ssDNA,FAM-ssDNA)作为荧光能量供体,冷冻法制备AuNPs-SEB适配体复合物,基于AuNPsSEB适配体复合物/SEB/FAM-ssDNA的竞争性结合,构建纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测方法。对缓冲体系pH和反应时间等条件进行优化,以牛奶为代表对方法检测性能进行验证。结果在优化好的实验条件(pH 7.5、反应时间15 min和反应温度25℃)下,在10^(-1)~10^(4)ng/mL范围内,荧光强度与SEB质量浓度之间呈现良好的线性关系,其相关系数为0.995,检出限为0.062 ng/mL。应用于牛奶样品中SEB的测定,方法回收率为91.2%~108.0%,相对标准偏差在2.6%~5.2%范围之间。结论该纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测技术具有简便、灵敏和准确等优点,可为食品中污染物的检测提供一种可行的新方法。