海洋链球菌次级代谢产物Streptochlorin对金黄色葡萄球菌诱发乳腺细胞氧化应激的保护作用

[目的]本试验旨在探讨Streptochlorin对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染引起小鼠乳腺上皮细胞氧化应激的影响及机制。[方法]采用海洋链球菌次级代谢产物Streptochlorin预处理小鼠乳腺上皮细胞指标检测(EpH4-Ev)2 h,适时加入S.aureus(MOI=10)共孵育4 h,收集样品;通过细胞活性检测、倒置荧光显微镜观察、生化指标检测、Western blot、RT-PCR等方法检测相关指标,并辅以计算机分子对接技术,明确Streptochlorin对S.aureus诱发乳腺上皮细胞氧化应激的影响及潜在机制。[结果]20μmol·L-1 Streptochlorin预处理能够明显改善S.aureus侵袭导致的乳腺上皮细胞排列紊乱、皱缩等形态改变,降低细胞损伤标志物乳酸脱氢酶(LDH)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的分泌以及肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)等炎性细胞因子的基因表达(P<0.05)。Streptochlorin预处理能显著降低乳腺上皮细胞胞内活性氧(ROS)水平,提高细胞总抗氧化能力(T-AOC)水平,减少丙二醛(MDA)水平(P<0.05)。Western blot检测以及分子对接结果显示,Streptochlorin可能通过Keap1-Nrf2信号通路促进下游分子血红素加氧酶1(HO-1)、NAD(P)H∶醌氧化还原酶1(NQO1)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的基因表达发挥抗氧化作用(P<0.05)。[结论]Streptochlorin对S.aureus感染小鼠乳腺上皮细胞诱发的氧化应激和炎症反应具有显著的保护作用,这可能与Keap1-Nrf2信号通路的激活有关。

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌nuc基因LAMP检测方法的建立

为了快速鉴定因金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛乳房炎,采用环介导等温扩增(LAMP)技术和传统PCR技术,针对金黄色葡萄球菌nuc基因设计特异性引物并进行扩增鉴定,同时对两种鉴定方法的最适反应条件、灵敏度和特异性进行了研究。结果显示,LAMP和传统PCR均能成功扩增金黄色葡萄球菌的nuc基因,但通过优化LAMP反应条件,在62℃时对nuc基因呈现最佳扩增效果,与传统PCR鉴定方法相比,LAMP对金黄色葡萄球菌nuc基因最低检测浓度为50 fg/μL,其检测灵敏度是PCR的10~4倍。说明LAMP能精准鉴定因金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎,且针对nuc基因的鉴定操作简单、特异性强、灵敏度高。

基于nuc基因的环介导等温核酸扩增可视化技术检测食源性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因作为检测靶基因,建立了一种检测金黄色葡萄球菌的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。该方法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA样品为阳性,而对单细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等食源性致病菌和猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌等猪源细菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明建立的LAMP方15法具有较好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP的检测限可达5.6×10^(1) CFU/mL,而常规PCR的检测限为5.6×10^(5) CFU/mL,即LAMP的检测灵敏度比常规PCR高出10000倍。临床样品的检测结果表明,50份猪肉样品中有4份检出金黄色葡萄球菌。本研究为食源性金黄色葡萄球菌提供了一种快速、可视化、特异性好、灵敏度高、成本低的LAMP检测方法。

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 △nuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcalnuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2△nuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220△nuc1。

金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株RN4220 Δnuc1的构建

金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因,一个是葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease,SNase),命名为nuc1,另一个是耐热核酸酶(Thermonuclease,TNase),命名为nuc2,nuc2是一个新的候选基因,以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因nuc1,为了进一步研究nuc2基因的功能,首先要将金黄色葡萄球菌nuc1基因缺失。研究目的就是通过构建同源重组质粒pBT2Δnuc1,将其电转入金黄色葡萄球菌菌株RN4220中,获得nuc1基因缺失突变株。经过了7轮培养和筛选,同源重组几率为2%(7/345),筛选出的nuc1突变株用PCR方法和RT-PCR进行了验证,从而获得了nuc1基因缺失突变株RN4220Δnuc1。

六灵解毒丸抑制金黄色葡萄球菌致大鼠急性咽炎的作用机制研究

目的探讨六灵解毒丸对金黄色葡萄球菌致大鼠急性咽炎的作用及机制。方法采用大鼠咽喉部注入1×10^(9)CFU·mL^(-1)的金黄色葡萄球菌溶液的方法复制急性咽炎大鼠模型。将SD大鼠随机分为空白组、模型组、蓝芩口服液组(5 mL·kg^(-1))及六灵解毒丸低、中、高剂量组(4.375、8.750、17.500 mg·kg^(-1)),每组10只。各组大鼠灌胃给药,每日1次,连续7 d。造模及给药期间每天观察并记录大鼠一般情况,并对咽喉局部炎症情况进行评分;采用苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠咽部组织病理学变化;ELISA法检测大鼠血清白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;免疫组化法及Western Blot法检测大鼠咽部组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠咽喉红肿程度显著增加,炎症评分显著升高(P<0.01),造模后第5~7天的体质量显著降低(P<0.05,P<0.01),咽部组织病理学评分显著升高(P<0.01),血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著上升(P<0.01),咽部组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,蓝芩口服液组及六灵解毒丸低、中、高剂量组大鼠的咽喉红肿明显减轻,炎症评分显著降低(P<0.01),血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著下降(P<0.01);蓝芩口服液组及六灵解毒丸中、高剂量组大鼠造模后第7天的体质量显著增加(P<0.01),咽部组织病理学评分及IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平均显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论六灵解毒丸可显著改善急性咽炎大鼠的症状及咽部组织炎症病理改变,其机制可能与下调IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子表达水平有关。

流感病毒-金黄色葡萄球菌共感染小鼠模型建立及达菲的干预作用研究

目的 模拟临床常见的流感病毒+金黄色葡萄球菌(金葡菌)共感染建立小鼠模型,评价达菲干预后的药效及对淋巴细胞和炎症因子调控作用。方法 (1)通过筛选不同滴度的PR8流感病毒、金葡菌,建立共感染小鼠模型。(2)选用雄性BALB/c小鼠,随机分为6组。第0天滴鼻流感病毒(0.25 TCID_(50),每只20μL),第3天滴鼻感染2.5×10^(7)CFU金葡菌20μL。感染病毒24 h后灌胃给药达菲,连续7 d。末次给药24 h后处死,计算脏器指数,RT-qPCR检测流感病毒M基因相对表达量,流式细胞术检测CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞含量及IL-6等13种炎症因子的分泌水平,以气泡图的形式显示每组促炎平均值和促炎细胞因子之和。结果 (1)0.25 TCID_(50)的流感病毒感染后体重下降相对平缓,小鼠没有出现死亡;(2)2.5×10^(7)CFU的金葡菌共感染后半数致死,体重下降相对平缓,作为后续共感染组的剂量;(3)共感染组小鼠体重下降较大,胸腺指数明显下降(P<0.05),肺指数明显升高(P<0.05)。与流感组相比,共感染组M基因表达量显著升高(P<0.05);与金葡组相比,细菌载量显著升高(P<0.05);与流感组和金葡组相比,小鼠淋巴细胞绝对含量明显降低(P<0.05),炎症因子含量显著增加(P<0.05)。达菲及时干预共感染小鼠后延缓了体重的下降,显著升高了胸腺指数(P<0.05),降低了肺指数(P<0.05);显著降低了M基因的表达和细菌载量(P<0.05);淋巴细胞含量显著升高(P<0.05);显著降低炎症因子的表达(P<0.05)。气泡图显示共感染组小鼠体内促炎症因子的平均值以及促炎因子之和均远远高于其他各组,达菲及时干预后有较好的回调作用。结论 本研究建立了符合临床特征的共感染小鼠模型,采用达菲干预治疗,可以减轻后续继发病毒-细菌混合感染对机体的损伤。

抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的胞内作用机制

研究副干酪乳杆菌FX-6产抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内抑菌作用机制。通过凝胶阻滞电泳、荧光光谱考察抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌DNA的结合作用及方式,考马斯亮蓝法检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳考察抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌蛋白合成的影响,邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法、荧光指示剂法分别测定抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌胞内β-半乳糖苷酶、非特异酯酶表达活性的影响,流式细胞仪分析F1对金黄色葡萄球菌细胞周期的影响。结果显示,抗菌肽F1能以嵌插方式与金黄色葡萄球菌细胞内的DNA结合,阻碍其遗传信息正常表达,使其蛋白的合成减少,并使胞内β-半乳糖苷酶、非特异性酯酶的表达活性减弱,胞内酶系统紊乱,影响其正常代谢,生长周期无法顺利进行,从而起到抑菌的效果。

用PCR与ELISA、RPLA对照检测乳腺炎金黄色葡萄球菌肠毒素和毒素休克综合征毒素-1

用PCR方法对14个奶牛场分离得到的临床型乳腺炎金黄色葡萄球菌(金葡菌)124株,隐性乳腺炎金葡菌213株,山羊临床型乳腺炎金葡菌12株进行超抗原毒素sea,seb,sec,sed.see和tst基因的分子调查,结果表明:奶牛标本肠毒素基因和tst基因的阳性率为27.42%,隐性乳腺炎为1.41%,山羊标本为33.3%。奶牛标本产生毒素的类型以SEA,TSST-1和SEC为主,山羊标本产生肠毒素的类型以SEC为主。对于肠毒素基因和tst基因PCR阳性的金葡菌同时用ELISA和RPLA检测,3种方法检测结果基本一致。

NOD1/NOD2介导的信号通路在小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎中的作用

为研究NOD1/NOD2介导的信号通路在金黄色葡萄球菌(S.aureus)引发小鼠乳腺炎中的作用,本实验通过人工接种不同剂量的S.aureus复制小鼠乳腺炎模型,利用组织切片法观察小鼠乳腺病理变化,采用荧光定量PCR方法检测乳腺组织中NOD1、NOD2、下游的受体作用蛋白2(RIP2)、核转录因子κB(NF-κB)以及炎性细胞因子TNF-α、IL-6的m RNA转录水平。结果显示,接种S.aureus的小鼠乳腺组织中炎性细胞增多,NOD1、NOD2、RIP2、NF-κB、IL-6、TNF-α的m RNA转录水平比未接种对照组均显著升高(p<0.05),TNF-α、IL-6的m RNA转录水平变化与NOD1/NOD2相一致。以上结果表明NOD1/NOD2受体及其介导的炎性信号通路参与了S.aureus感染小鼠乳腺的免疫反应。

金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素1基因的检测

目的检测编码金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素l(TSST-1)的tst基因,了解该基因的携带情况。方法用PCR法对产毒素金黄色葡萄球菌染色体上编码TSST-1的tst基因进行体外扩增,并对临床分离的84株金黄色葡萄球菌进行tst基因检测及序列分析。结果对tst基因进行了检测及测序,84株受检的金黄色葡萄球菌中,tst基因阳性株占19.05%(16/84),测序结果与GenBank公布的金黄色葡萄球菌产TSST-1基因的同源性较高。结论用PCR法检测tst基因,具有良好的重复性、特异性和敏感性。tst基因阳性株在临床分离的金黄色葡萄球菌中占有较高的比例。

金黄色葡萄球菌诱导小鼠乳腺纤维化模型TGF-β1的表达

为探究金黄色葡萄球菌(S.aureus)引起乳腺纤维化的致病分子机制,本研究以不同剂量(10~4 cfu/m L、10~6cfu/m L、10~8cfu/m L、10^(10)cfu/m L)的S.aureus感染哺乳期BALB/c小鼠乳腺组织,观察小鼠临床症状和病理组织学变化,筛选建立小鼠乳腺纤维化模型的S.aureus感染剂量。感染小鼠后分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d采集小鼠乳腺组织,通过病理组织学观察、免疫组化染色、荧光定量PCR、western blot等方法,研究乳腺纤维化、TGF-β1的表达分布状况,检测TGF-β1的m RNA的转录和蛋白表达水平。结果显示108 cfu/m L S.aureus感染哺乳期小鼠21 d时出现乳腺组织纤维化,确定其为建立小鼠乳腺纤维化模型的感染菌剂量。10~8 cfu/m L S.aureus感染小鼠乳腺组织后,TGF-β1主要由巨噬细胞(感染后1 d、3 d、5 d)、乳腺成纤维细胞(感染后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d)及乳腺上皮细胞(感染后7 d、14 d、21 d)表达;在感染后3 d～7 d时小鼠乳腺组织中TGF-β1的表达先升高后降低,感染后14 d、21 d时其表达再次升高,并显著高于对照组(p<0.01)。本研究表明通过S.aureus感染小鼠乳腺可以建立小鼠乳腺纤维化模型,并能够促进感染后小鼠巨噬细胞、乳腺成纤维细胞、乳腺上皮细胞中TGF-β1的表达,TGF-β1在小鼠乳腺纤维化的发生发展过程中具有重要的促进作用。

金黄色葡萄球菌α-toxin(Hla)促进皮肤组织中IL-19表达上调的作用机制研究

目的探究金黄色葡萄球菌α-toxin(Hla)促进皮肤组织中IL-19表达上调的作用机制。方法采用WT S.Aureus、△Hla S.aureus(Hla缺失菌株)以及PBS感染Balb/c小鼠背部皮肤,收集感染后第1、3、7天的皮肤组织,HE染色检测组织炎性病理损伤,q RT-PCR和ELISA分别检测IL-19、IL-1β的m RNA和蛋白水平的表达。分离小鼠骨髓的中性粒细胞,分别用WT S.Aureus、△Hla S.aureus以及meida(不含菌液的培养基)刺激6 h后,q RT-PCR、ELISA和Western blot检测IL-1β的表达。不同浓度IL-1β刺激角质形成细胞PAM 2-12后,q RT-PCR和ELISA分别检测IL-19的表达。结果△Hla S.aureus组与WT S.aureus组相比,其皮肤损伤的面积减小,炎性细胞浸润和脓肿形成减少。同时q RT-PCR和ELISA检测发现,△Hla S.aureus组与WT S.aureus组相比,IL-19的m RNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。体外中性粒细胞刺激发现,△Hla S.aureus组与WTS.aureus组相比,IL-1β蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。体外IL-1β刺激角质形成细胞PAM 2-12发现,与不刺激组相比,IL-19的m RNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.01),并呈剂量依赖性。结论金黄色葡萄球菌分泌的α-toxin能够作用于中性粒细胞,促进了IL-1β的表达,IL-1β的过表达作用于皮肤的角质形成细胞,从而促进了IL-19的上调,可能参与了银屑病的发生与发展。

金黄色葡萄球菌GST-mTSST-1的免疫活性检测方法的研究

通过对影响琼脂扩散反应的多种条件进行优化,建立了检测金黄色葡萄球菌无毒诱变中毒性休克综合征毒素1融合蛋白GST-mTSST-1免疫活性的双向免疫琼脂扩散检测方法.检测的灵敏度可达到120ng/mL.此方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等特点,对具有免疫活性的抗原蛋白的定量检测有一定的参考价值.

分泌抗金黄色葡萄球菌C1型肠毒素杂交瘤细胞系的建立及初步应用

应用常规方法建立了３株稳定分泌抗金黄色葡萄球菌Ｃ１型肠毒素（ＳＥＣ１）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的小鼠杂交瘤细胞系Ｂ３、Ｃ４和Ｇ８。其中Ｂ３和Ｃ４均为ＩｇＧ１（ｋ），Ｇ８为ＩｇＧ２ａ（ｋ）。Ｂ３和Ｇ８与ＳＥＡ、ＳＥＢ及ＳＥＤ均无交叉反应；Ｃ４虽与ＳＥＡ和ＳＥＤ无交叉反应，但与ＳＥＢ有交叉反应。间接ＥＬＩＳＡ测定小鼠腹水效价为１０－５～１０－８。应用识别不同表位的ＭｃＡｂ建立了双ＭｃＡｂ夹心ＥＬＩＳＡ法检测ＳＥＣ１，敏感性可达１ｎｇ／ｍｌ。

金黄色葡萄球菌nuc基因特异性核酸探针的制备及应用

目的 建立核酸探针检测实验动物金黄色葡萄球菌的方法。方法 将重组质粒pGEM NUC中金黄色葡萄球菌nuc基因特异性片段酶切回收 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验探针 ,对细菌菌株及临床样品进行了检测。结果 核酸探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌等其他细菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交检测的灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 32 2份SPF小鼠的临床样品进行了检测 ,检出率为 3 1% (10 /32 2 ) ,符合率为 10 0 % ,与细菌学检查的结果相一致。结论 建立的DNA探针检测金黄色葡萄球菌方法具有高度的特异性和敏感性 ,且较快速 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的监测。

金黄色葡萄球菌血流感染患儿近期预后影响因素及mNAP、Presepsin、TREM-1的预后预测价值

目的探讨金黄色葡萄球菌血流感染患儿的近期预后影响因素及中性粒细胞膜碱性磷酸酶(mNAP)、可溶性白细胞分化抗原14亚型(Presepsin)、髓样细胞触发受体-1(TREM-1)的预后预测价值。方法收集2018年1月—2019年12月金黄色葡萄球菌血流感染106例作为感染组,根据患儿治疗30 d的生存情况,将其分为死亡组(n=11)、生存组(n=95)。将同期接受体检的健康儿童100例作为正常对照组。对比感染组与正常对照组血清mNAP、Presepsin、TREM-1水平,以及不同预后金黄色葡萄球菌血流感染患儿临床资料的差异,同时分析影响金黄色葡萄球菌血流感染患儿近期预后的独立危险因素及血清mNAP、Presepsin、TREM-1对预后的预测价值。结果感染组血清mNAP、Presepsin、TREM-1水平高于正常对照组(P<0.05)。死亡组与生存组白细胞、淋巴细胞、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、mNAP、Presepsin、TREM-1水平及急性生理与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分比较差异有统计学意义(P<0.01)。白细胞、淋巴细胞、APACHEⅡ评分、CRP、PCT、mNAP、Presepsin、TREM-1水平较高均是影响金黄色葡萄球菌血流感染患儿近期死亡的独立危险因素(P<0.05)。血清mNAP、Presepsin、TREM-1预测金黄色葡萄球菌血流感染患儿近期死亡的曲线下面积分别为0.822、0.744、0.794。结论mNAP、Presepsin、TREM-1水平较高是影响金黄色葡萄球菌血流感染患儿近期死亡的独立危险因素,三者对患儿近期死亡具有早期预测价值。

MecA、Nuc基因在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的应用

目的通过对180株金黄色葡萄球菌临床分离株MecA、Nuc基因的检测,以期选择出一种适合临床的并能简便、快速、准确检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的方法。方法细菌鉴定及药敏采用全自动细菌鉴定和药敏分析仪。MecA、Nuc基因检测采用荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)法。结果 FQ-PCR对180株金黄色葡萄球菌MecA、Nuc基因检出率为75.0%,全自动细菌鉴定和药敏分析仪对180株金黄色葡萄球菌的MRSA检出率为72.8%,2种检测方法比较差异无统计学意义(P>0.05)。全自动细菌鉴定和药敏分析仪对MRSA的检测正确率为94.8%。结论 FQ-PCR检测MRSA正确率高,只需要1~2 h即可完成。该方法快速、简便、准确,值得推广应用。

金黄色葡萄球菌荚膜多糖血清1型和2型的研究进展

金黄色葡萄球菌荚膜多糖在其感染中起着重要的作用。文章主要介绍了荚膜多糖血清1型和2型的发现、生化性质及其在免疫中的作用。天然荚膜多糖只对同株型起到保护作用,而纯化的荚膜多糖只有少量的免疫原性。从而了解到完全抗原只能用灭活金黄色葡萄球菌或者纯化的荚膜多糖结合蛋白质来实现。

PCR扩增nuc基因快速检测金黄色葡萄球菌

为快速检测标本中金黄色葡萄球菌（以下简称金葡菌）。应用聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增金葡菌ｎｕｃ基因，并与培养法进行比较分析。结果只有金葡菌扩增出一条特异的ＤＮＡ条带，平行对照的其它菌株均为阴性。说明用ＰＣＲ检测金葡菌的方法简便、快速、特异、敏感。