鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。

酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量PCR法对乙型肝炎的诊断价值比较

目的比较酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在乙型肝炎诊断中的应用价值。方法选取120例疑似乙型肝炎患者作为本次研究对象,分别进行酶联免疫吸附测定法以及实时荧光定量PCR法检验。以病理检查为金标准,分析酶联免疫吸附测定法和实时荧光定量PCR法的检查结果,对比两种检查方法的诊断效能,包括特异度、灵敏度以及准确度。结果120例疑似患者经病理检查确诊75例为乙型肝炎。酶联免疫吸附测定法检出阳性74例,阴性46例;实时荧光定量PCR法检出阳性75例,阴性45例。实时荧光定量PCR法检测乙型肝炎的特异度、灵敏度以及准确度分别为93.33%、96.00%、95.00%,均明显高于酶联免疫吸附测定法的73.33%、82.67%、79.17%,差异有统计学意义(χ^(2)=6.4800、6.9963、13.3724,P<0.05)。结论采用实时荧光定量PCR法进行乙型肝炎的检测具有较高的准确率,可以为医生诊断和治疗方案的制定及调整提供良好的依据。

抗酸涂片与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测在耐药肺结核诊断中的应用价值

目的探讨抗酸涂片与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert MTB/RIF)检测在耐药肺结核(PTB)诊断中的应用价值。方法选取2020年3月至2022年3月福建省漳州市龙海区疾病预防控制中心收治的95例疑似耐药PTB患者作为研究对象。采集患者的纤维支气管镜肺泡灌洗液进行病原菌分离鉴定(阳性标本进行药敏试验)及抗酸涂片与Xpert MTB/RIF检测。比较病原菌分离鉴定和药敏试验、抗酸涂片及Xpert MTB/RIF检测的阳性率,并以病原菌分离鉴定和药敏试验结果为金标准,比较抗酸涂片、Xpert MTB/RIF检测对耐药PTB的诊断价值及与金标准的一致性。结果95例疑似耐药PTB患者病原菌分离鉴定和药敏试验阳性率为36.84%(35/95),抗酸涂片阳性率为29.47%(28/95),Xpert MTB/RIF检测阳性率为42.11%(40/95),差异有统计学意义(P<0.05)。以病原菌分离鉴定和药敏试验结果为金标准,Xpert MTB/RIF检测的诊断灵敏度、特异度、准确度均高于抗酸涂片,且与金标准的一致性高于抗酸涂片,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抗酸涂片与Xpert MTB/RIF检测均对耐药PTB具有良好的诊断价值,但Xpert MTB/RIF检测的价值优于抗酸涂片。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank收录的PRRSV基因序列,利用PRRSV经典变异株与缺失变异株NSP2基因序列特点,设计合成两对特异性引物,经RT-PCR扩增后,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,并转化到大肠杆菌DH-5a株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV缺失变异株与经典变异株的阳性重组质粒。将重组标准质粒进行10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR法(Real-timePCR),建立了PRRSV缺失变异株与经典变异株的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为鉴别诊断及分析PRRSV缺失变异株与经典变异株感染猪体内病毒的绝对含量提供了技术手段。

赤羽病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏的赤羽病病毒(Akabanediseasevirus,AKAV)核酸检测方法,以AKAV S基因为靶基因,设计特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应体系和条件,建立了AKAV荧光定量RT-PCR检测方法,随后开展了敏感性、特异性及重复性评估,并利用该方法与AKAV检疫行业标准推荐方法同时对临床采集的80份牛羊血液样品进行检测,以检验方法的临床应用效果。结果显示:本研究建立的检测方法敏感性较高,最低检测限为13.4 copies/μL;特异性良好,与口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛病毒性腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒、牛白血病病毒等均无交叉反应;组内试验变异系数为0.93%~2.47%,组间试验为1.25%~2.76%,重复性良好;利用建立的方法从80份临床样品中检出AKAV阳性样品21份,该检测结果与AKAV检疫行业标准推荐方法的符合率为98.75%。结果表明,本研究建立的AKAV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性高,特异性及重复性好,适用于赤羽病临床检测,为赤羽病病原学监测和诊断技术标准开发提供了技术支撑。

牛呼吸道合胞体病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明:本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。

黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌的实时荧光定量PCR检测方法建立

本研究成功建立了一种针对黄芪根腐病菌腐皮镰刀菌(Fusarium solani)的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。该方法基于腐皮镰刀菌翻译延伸因子EF-1α基因序列,设计了特异性引物对FP.F/FP.R,并验证其特异性。建立腐皮镰刀菌的RT-qPCR检测方法;运用所建方法检测黄芪及土壤中腐皮镰刀菌的含量,验证其检测效果。结果表明:设计的引物FP.F/FP.R特异性强,RT-qPCR检测的灵敏度为0.0192 ng/μL,重复性评价显示方法稳定、可靠。应用该RT-qPCR方法,可从黄芪接种发病和疑似发病样本及土壤样本中检测出腐皮镰刀菌。结果表明,3组样本的总阳性检出率均为100%。同时,植株和土壤中腐皮镰刀菌的含量变化与根腐病的严重度基本一致。因此,本研究建立的RT-qPCR方法能够有效地用于黄芪植株及土壤中腐皮镰刀菌的定量检测,为根腐病的早期诊断、预警和病原菌的动态监测提供了重要的技术支持。

miR-451a和miR-21-5p双重实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR方法的建立

为了寻找一种能够鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株与其他布氏杆菌菌株的双重实时荧光定量PCR检测方法。针对布氏杆菌菌株的16S rRNA和Bp26基因,各设计一套引物和探针,并优化反应体系和反应程序。以布氏杆菌A19、S2、M5-90和M5-90△26四种疫苗株以及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的特异性。克隆构建PCR_16S rRNA_Bp26标准品,通过倍比稀释进行双重荧光定量PCR扩增,评价该方法的灵敏度。使用该方法与虎红平板凝集试验、试管凝集试验进行检测结果对比,评价该方法的可行性。结果显示,本方法特异性好,布氏杆菌A19、S2、M5-90三种疫苗株均同时出现Bp26基因和16S rRNA基因的扩增,布氏杆菌M5-90△26疫苗株只出现16S rRNA基因的扩增,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、沙门氏菌、链球菌均未出现扩增曲线。该方法建立的16S rRNA基因序列扩增通道和Bp26基因序列扩增通道对标准品的最低检测限均达5 copies/μL。该方法对临床样本的检测结果与虎红平板凝集试验、试管凝集试验检测结果符合率较高,说明建立的羊种布氏杆菌M5-90△26基因缺失疫苗双重实时荧光定量PCR检测方法可用于临床的检测,为鉴别布氏杆菌M5-90△26疫苗株免疫与布氏杆菌野毒株感染提供一种可行的检测方法。

实时荧光定量PCR检测肺泡灌洗液在HIV阴性马尔尼菲篮状菌病诊断中的价值

目的探讨实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测HIV阴性支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)对马尔尼菲篮状菌病诊断价值。方法收集2019年9月—2022年6月就诊于广西医科大学第一附属医院的17例HIV阴性有肺部感染症状的TSM患者及33例肺部其他真菌感染患者或非感染患者的BALF及血清标本,分别提取总DNA,运用qPCR技术检测标本中TM菌载量值,并同时进行BALF真菌培养。结果同一时间采集的17例外周血和支气管肺泡灌洗液中,在外周血样本中qPCR检测阳性仅11.8%(2/17),BALF真菌培养TM阳性患者同份BALF标本qPCR阳性率可达90.0%(9/10);BALF真菌培养TM阴性患者中,其同份标本有2例qPCR检测呈阳性。33例对照组患者的血清及BALF qPCR均为阴性。其中,BALF qPCR阳性样本的Cq值中位数为31.40,范围为20.71~35.59。同份BALF样本中,BALF qPCR技术(Kappa值:0.708)比BALF培养(Kappa值:0.653)及BALF镜检(Kappa值:0.220)对HIV阴性TSM患者具有更高的诊断效能。结论qPCR技术应用于BALF标本对HIV阴性有肺部感染症状的马尔尼菲篮状菌病患者的早期诊断具有较高的应用价值。

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。

基于SYBR Ⅰ实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立

本研究参考GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)野毒株和弱毒疫苗株(CV777弱毒疫苗株)在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异,设计一对特异性荧光定量引物,分别建立基于SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。结合熔解曲线分析可见,其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(81.84±0.17)℃和(83.16±0.14)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现1个单特异峰,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号。结合熔解曲线可直接鉴别猪群中PEDV的感染情况和程度,可对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断,尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。

一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用

根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应;可以检出20个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)低于4%,方法重复性好。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对50份疑似病例组织进行检测,结果荧光定量RT-PCR检出30份PRRSV阳性,13份CSFV阳性,均高于常规RT-PCR方法的检出数(24份PRRSV阳性,10份CSFV阳性)。本研究建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高的特点,可用于PRRSV和CSFV的实验室快速诊断和流行病学调查。

应用实时荧光定量RT-PCR法建立肝癌分子诊断指数

目的:筛选肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中表达水平较正常肝细胞差异大、特异性好的基因,建立肝癌分子诊断指数,以期从分子病因学角度实现对肝癌的早期诊断.方法:随机选择38例手术切除组织标本,其中正常肝5例、肝炎4例、肝硬化(LC)12例、HCC和癌旁组织17例,实时荧光定量RT-PCR检测9个基因的表达,以管家基因G3PDH为对照,2-△△CT法计算目的基因相对表达量,依据表达异常的基因个数建立分子诊断指数.结果:GPC3等6个基因在正常肝、肝炎、LC与HCC组的两组或多组间存在差异(P<0.05);GPC3、E2F1从肝炎组到LC、HCC组呈递增趋势,HGF、CLDN10在LC组表达量升高,而在HCC组明显下降,PTEN、PRDM2、MGMT从肝炎组到LC、HCC组呈递减趋势;9个基因在LC组分子诊断指数平均值为1.58,在HCC组平均值为5.24,二者差异显著;GPC3、E2F1、MMP2从癌旁到癌呈递增趋势,CLDN10、HGF、PTEN、DLC1、PRDM2、MGMT从癌旁到癌呈递减趋势.结论:通过筛选更多基因的组合分析,分子诊断指数有望成为鉴别诊断早期肝癌的一种有效方法.

BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示:建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。

传染性胰脏坏死病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

传染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)是一种严重危害鲑鳟鱼类的重要传染性病原。为建立IPNV快速检测方法,根据IPNV VP2蛋白编码基因保守序列,设计并筛选出特异性引物和Taq Man探针,并优化筛选引物以及探针检测浓度、退火温度和退火时间,建立了一种实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对方法进行了评价。结果显示:该方法灵敏度高,对IPNV的检测限为5 copies/μL;特异性强,对传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒、草鱼呼肠孤病毒、流行性造血器官坏死病毒等其他病毒核酸扩增均呈阴性;重复性良好,组内与组间重复平均变异系数均小于3%;用本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法,对40份经病毒分离鉴定的样品进行IPNV检测,符合率为100%。结果表明,本研究建立的方法具有快速、特异、敏感等优点,可检测病毒含量较低的组织样品,对于IPNV的快速检测更具优势。

荧光染色与实时荧光定量PCR法检测在肺结核辅助诊断中的应用效果分析

探究肺结核辅助诊断中最有效的方式。方法 样本选取时间:(2021年1月-2022年6月);样本选取对象:疑似肺结核患者800例;以肺结核基层诊疗指南(实践版·2018)为金标准。分析诊断结果。结果 诊断结果:800例疑似患者中,阳性324例,阴性476例。荧光染色检测:真阳304例、假阳29例、真阴447例、假阴20例;实时荧光定量PCR法:真阳305例、假阳25例、真阴451例、假阴19例;联合:真阳314例、假阳1例、真阴475例、假阴10例。与荧光染色、实时荧光定量PCR法检测相比,联合方式诊断准确性、诊断灵敏性、特异性更高(P<0.05)。结论 荧光染色与实时荧光定量PCR法检测联合诊断肺结核具有较高的诊断效能,可实现早诊断、早治疗,临床应用价值显著,可继续推广及应用。